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細胞焦亡（pyroptosis）是一種最近發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。
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一、介紹
細胞焦亡（pyroptosis）是一種最近發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。自2015年以來，邵峰院士等人發(fā)現(xiàn)，caspase-1和caspase-11/4/5是通過切割一個叫做Gasdermin-D（GSDMD）的蛋白而誘發(fā)細胞焦亡的，GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，釋放出其N端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合膜脂并在細胞膜上打孔的活性，這樣就導(dǎo)致細胞滲透壓的變化而發(fā)生脹大直至最終細胞膜的破裂（Shi et al., Nature 2015；Ding et al., Nature 2016）。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，對細胞焦亡的深入研究有助于認識其在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，為臨床防治提供新思路。近幾年，細胞焦亡的研究熱度迅猛上升，已成功吸引科學(xué)家們的眼球，一躍成為熱門研究領(lǐng)域。
細胞焦亡（pyroptosis）、細胞凋亡（apoptosis）、細胞自噬（autophagy）、細胞壞死性凋亡(necroptosis)都是程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）的表現(xiàn)形式，程序性細胞死亡是指細胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程。細胞凋亡由凋亡性caspase（Caspase-2, 3, 6, 7, 8, 9或人類caspase-10）介導(dǎo)。與細胞凋亡相比，細胞焦亡是由炎癥性caspase（Caspase-1, 4, 5, 11）誘導(dǎo)的一類壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡。相比于細胞凋亡，細胞焦亡發(fā)生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。由于細胞焦亡需要炎癥性caspase的參與，其與另一種壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡方式—壞死性凋亡不一樣，壞死性凋亡發(fā)生不需要caspase的參與。
二、特點
細胞焦亡發(fā)生時，細胞會發(fā)生腫脹，在細胞破裂之前，細胞上形成凸出物（圖1，細胞焦亡Early），之后細胞膜上形成孔隙，使細胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，此時，細胞核位于細胞中央（圖1，細胞焦亡Late），隨著形態(tài)學(xué)的改變，細胞核固縮，DNA斷裂。
細胞焦亡過程，具有caspase-1依賴性。在外界條件的刺激下，caspase-1前體可以與模式識別受體NLRP1、NLRP3等通過接頭蛋白ASC變?yōu)橐粋�高分子復(fù)合物，即炎癥小體，也稱依賴caspase-1的炎癥小體。細胞在caspase-1激活同時會釋放出炎性因子白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和IL-18，進而吸引更多的炎性細胞，加重炎癥反應(yīng)。
焦亡發(fā)生時形成孔隙，它允許細胞質(zhì)的內(nèi)容物，如乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）和炎性細胞因子釋放，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V、7-氨基放線菌D或碘化丙啶進入細胞。
三、信號通路
細胞焦亡屬于炎癥性死亡途徑，按激活機制，可分為Caspase-1依賴和不依賴兩種途徑。兩種途徑都是通過切割GSDMD后形成N端游離的肽段，這一肽段會誘導(dǎo)細胞形成孔道并導(dǎo)致細胞破裂，釋放胞質(zhì)成分。兩種途徑都能同時誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激活Caspase-1。
細胞焦亡的機制
炎性小體激活的分子機制與焦亡的誘導(dǎo)發(fā)生需要兩步機制：第一步是啟動步驟，促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等的轉(zhuǎn)錄生成。第二步是激活炎性復(fù)合物，炎性復(fù)合物包括NLR（NOD-like receptors，胞漿內(nèi)感受器）蛋白家族成員、銜接蛋白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1，其中NLR蛋白家族成員中NLRP3是細胞焦亡中的主要炎性復(fù)合物。
（1）細胞焦亡發(fā)生的經(jīng)典通路：在病原體、細菌等信號的刺激下，細胞內(nèi)的NLR識別這些信號，通過銜接蛋白ASC與Pro-Caspase-1結(jié)合，激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GasderminD，形成GasderminD氮端和碳端，GasderminD氮端就會和細胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合，形成孔洞，釋放內(nèi)容物，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生；另一方面，活化的Caspase-1對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，造成炎癥反應(yīng)；
（2）依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑：以炎性刺激因子LPS為例，沒有通過受體直接進入細胞質(zhì)內(nèi)，Caspase 其它家族成員如Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生；另一方面，誘導(dǎo)Caspase-1的活化，對IL-1β和IL-18的前體進行切割，造成炎癥反應(yīng)。
四、細胞焦亡的研究方法
細胞焦亡的機制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關(guān)鍵信號，因此證明所誘發(fā)的細胞死亡方式是否為細胞焦亡，需要幾個關(guān)鍵的實驗證據(jù)：
（1） GSDMD的切割 （Western檢測）；
（2） Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11。（Western檢測）；
（3） IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放 （Western，ELISA等）；
（4）細胞形態(tài)學(xué)檢測（CCK-8等）；
（5）染色質(zhì)完整性檢測 （Tunel等）。
完整檢測方式如下：
1、形態(tài)變化
（1）掃描電鏡觀察細胞形態(tài)；
（2）免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）；
（3）Tunel檢測。
2、檢測焦亡相關(guān)基因及蛋白
（1）q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；
（2）ELISA試劑盒檢測炎癥因子的水平；
（3）CCK8法測定細胞活力；
（4）免疫組化檢測組織蛋白的表達。
【歡迎來電/郵件咨詢】
聯(lián)系人：劉經(jīng)理
電話：021-54376058
手機：13917998048 (7:00-24:00, 周末節(jié)假日不休)
郵箱：yanzaibio@yihaowan.cn, yanzaibio@163.com
官網(wǎng)：www.yihaowan.com.cn
地址： 上海市閔行區(qū)放鶴路1088號博濟科技園6號樓109室
細胞焦亡（pyroptosis）是一種最近發(fā)現(xiàn)的細胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。自2015年以來，邵峰院士等人發(fā)現(xiàn)，caspase-1和caspase-11/4/5是通過切割一個叫做Gasdermin-D（GSDMD）的蛋白而誘發(fā)細胞焦亡的，GSDMD在被caspase-1或caspase-11/4/5切割后，釋放出其N端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合膜脂并在細胞膜上打孔的活性，這樣就導(dǎo)致細胞滲透壓的變化而發(fā)生脹大直至最終細胞膜的破裂（Shi et al., Nature 2015；Ding et al., Nature 2016）。細胞焦亡是機體重要天然免疫反應(yīng)，在拮抗感染和內(nèi)源危險信號中發(fā)揮重要作用。細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發(fā)生發(fā)展，對細胞焦亡的深入研究有助于認識其在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，為臨床防治提供新思路。近幾年，細胞焦亡的研究熱度迅猛上升，已成功吸引科學(xué)家們的眼球，一躍成為熱門研究領(lǐng)域。
細胞焦亡（pyroptosis）、細胞凋亡（apoptosis）、細胞自噬（autophagy）、細胞壞死性凋亡(necroptosis)都是程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD）的表現(xiàn)形式，程序性細胞死亡是指細胞接受某種信號或受到某些因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程。細胞凋亡由凋亡性caspase（Caspase-2, 3, 6, 7, 8, 9或人類caspase-10）介導(dǎo)。與細胞凋亡相比，細胞焦亡是由炎癥性caspase（Caspase-1, 4, 5, 11）誘導(dǎo)的一類壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡。相比于細胞凋亡，細胞焦亡發(fā)生的更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。由于細胞焦亡需要炎癥性caspase的參與，其與另一種壞死性和炎癥性的細胞程序性死亡方式—壞死性凋亡不一樣，壞死性凋亡發(fā)生不需要caspase的參與。
二、特點
細胞焦亡發(fā)生時，細胞會發(fā)生腫脹，在細胞破裂之前，細胞上形成凸出物（圖1，細胞焦亡Early），之后細胞膜上形成孔隙，使細胞膜失去完整性，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，此時，細胞核位于細胞中央（圖1，細胞焦亡Late），隨著形態(tài)學(xué)的改變，細胞核固縮，DNA斷裂。
細胞焦亡過程，具有caspase-1依賴性。在外界條件的刺激下，caspase-1前體可以與模式識別受體NLRP1、NLRP3等通過接頭蛋白ASC變?yōu)橐粋�高分子復(fù)合物，即炎癥小體，也稱依賴caspase-1的炎癥小體。細胞在caspase-1激活同時會釋放出炎性因子白細胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和IL-18，進而吸引更多的炎性細胞，加重炎癥反應(yīng)。
焦亡發(fā)生時形成孔隙，它允許細胞質(zhì)的內(nèi)容物，如乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）和炎性細胞因子釋放，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V、7-氨基放線菌D或碘化丙啶進入細胞。
三、信號通路
細胞焦亡屬于炎癥性死亡途徑，按激活機制，可分為Caspase-1依賴和不依賴兩種途徑。兩種途徑都是通過切割GSDMD后形成N端游離的肽段，這一肽段會誘導(dǎo)細胞形成孔道并導(dǎo)致細胞破裂，釋放胞質(zhì)成分。兩種途徑都能同時誘導(dǎo)IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成成熟的IL-1β和IL-18。不同的只是是否直接激活Caspase-1。
細胞焦亡的機制
炎性小體激活的分子機制與焦亡的誘導(dǎo)發(fā)生需要兩步機制：第一步是啟動步驟，促炎因子如 proIL-1β、Nlrp3和caspase-11等的轉(zhuǎn)錄生成。第二步是激活炎性復(fù)合物，炎性復(fù)合物包括NLR（NOD-like receptors，胞漿內(nèi)感受器）蛋白家族成員、銜接蛋白ASC/TMS1和Pro-Caspase-1，其中NLR蛋白家族成員中NLRP3是細胞焦亡中的主要炎性復(fù)合物。
（1）細胞焦亡發(fā)生的經(jīng)典通路：在病原體、細菌等信號的刺激下，細胞內(nèi)的NLR識別這些信號，通過銜接蛋白ASC與Pro-Caspase-1結(jié)合，激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割GasderminD，形成GasderminD氮端和碳端，GasderminD氮端就會和細胞膜上的磷脂蛋白結(jié)合，形成孔洞，釋放內(nèi)容物，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生；另一方面，活化的Caspase-1對IL-1β和IL-18的前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，造成炎癥反應(yīng)；
（2）依賴Caspase-4、5、11的非經(jīng)典途徑：以炎性刺激因子LPS為例，沒有通過受體直接進入細胞質(zhì)內(nèi)，Caspase 其它家族成員如Caspase-4、5、11被活化，活化的Caspase-4、5、11切割GasderminD，誘導(dǎo)焦亡發(fā)生；另一方面，誘導(dǎo)Caspase-1的活化，對IL-1β和IL-18的前體進行切割，造成炎癥反應(yīng)。
四、細胞焦亡的研究方法
細胞焦亡的機制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關(guān)鍵信號，因此證明所誘發(fā)的細胞死亡方式是否為細胞焦亡，需要幾個關(guān)鍵的實驗證據(jù)：
（1） GSDMD的切割 （Western檢測）；
（2） Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11。（Western檢測）；
（3） IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放 （Western，ELISA等）；
（4）細胞形態(tài)學(xué)檢測（CCK-8等）；
（5）染色質(zhì)完整性檢測 （Tunel等）。
完整檢測方式如下：
1、形態(tài)變化
（1）掃描電鏡觀察細胞形態(tài)；
（2）免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）；
（3）Tunel檢測。
2、檢測焦亡相關(guān)基因及蛋白
（1）q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關(guān)基因或蛋白的表達水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；
（2）ELISA試劑盒檢測炎癥因子的水平；
（3）CCK8法測定細胞活力；
（4）免疫組化檢測組織蛋白的表達。
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