4D-Label free 相對定量蛋白質(zhì)組

       非標記（Label free）蛋白定量，是通過比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強度，分析不同樣品蛋白的數(shù)量變化，通過適當?shù)臄?shù)學(xué)公式可以將質(zhì)譜檢測計數(shù)與蛋白質(zhì)的量聯(lián)系起來，從而對蛋白質(zhì)進行定量。該技術(shù)不需要對樣品進行任何標記，每個樣品可單獨上機，樣品蛋白直接酶解后經(jīng)過質(zhì)譜分析產(chǎn)生數(shù)據(jù)，通過軟件分析后即可確定蛋白質(zhì)在樣品中表達量的變化情況。
       利用新一代timsTOF  Pro質(zhì)譜儀，通過捕獲雙TIMS（Trapped  Ion  Mobility  Spectrometry）-離子淌度譜技術(shù)與同步累積連續(xù)碎裂（PASEF）掃描模式對樣本進行差異定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在傳統(tǒng)3D分離（保留時間、質(zhì)荷比、離子強度）基礎(chǔ)上，增加肽段的碰撞截面積（CCS），實現(xiàn)4D的分離檢測。4D-  Label  free具有更快的速度、更高的靈敏度、更強的穩(wěn)定性，可以實現(xiàn)檢測各種不同基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，包括單細胞、血清、血漿、腦脊液和尿液等微量樣本。

實驗流程        本項目分析流程主要包括質(zhì)譜實驗和數(shù)據(jù)分析兩個階段。
       質(zhì)譜實驗分析流程主要包括蛋白質(zhì)提取、肽段酶解、色譜分級（可選項）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)庫檢索和生信分析等步驟，見上圖。

技術(shù)原理：
     用質(zhì)譜儀開展的蛋白組學(xué)研究中，質(zhì)譜的掃描速度會影響蛋白的鑒定深度。引入雙TIMS/PASEF®（ParallelﾠAccumulation Serial Fragmentation 平行累積串行碎裂）分離技術(shù)的 timsTOF Pro平臺，與傳統(tǒng)的 3D 分離技術(shù)（保留時間（retentionﾠtime）、質(zhì)荷比（m/z）、離子強度（intensity））相比，增加了第四個維度⸺離子淌度（mobility），進而大幅度的提高了掃描速度和檢測靈敏度，大幅提升蛋白鑒定的數(shù)量和覆蓋率。timsTOFﾠPro創(chuàng)新性地使用了雙TIMS分離/富集裝置，離子在第一個TIMS部分中進行累積，在第二個TIMS中根據(jù)淌度進行分離，經(jīng)過分離后的離子繼續(xù)用于MS/MS碎裂。往復(fù)進行此過程，當?shù)诙�個TIMS進行分離時，第一個TIMS也同時在平行地累積離子，這樣可以實現(xiàn)近乎100％的離子利用率。減少 1 價離子（雜離子）的干擾。

樣品要求
細胞：5×10⁶個細胞；動物組織：200mg；植物組織：800mg；微生物：400mg；血清血漿：300μl

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一個細胞或組織中整個基因組表達的全部蛋白質(zhì)就是蛋白質(zhì)組的研究內(nèi)容。蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即在高通量水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此從蛋白質(zhì)水平上解析疾病發(fā)生的分子機制，獲得細胞代謝等過程的全面認識。



Pubmed收錄“proteomics”文獻統(tǒng)計
   2020年12月，Nature Methods上發(fā)表了《diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition》一文，標志著蛋白質(zhì)組學(xué)研究正式進入了4D時代。文章中提到的timsTOF Pro 4D質(zhì)譜技術(shù)通過分析分子量和離子淌度的相關(guān)性，搭配新的DIA數(shù)據(jù)采集模式，不僅覆蓋了選擇窗口中整個質(zhì)核比范圍，還提高了識別入射離子的分辨率，從而鑒定到更多的蛋白質(zhì)種類，讓蛋白質(zhì)組學(xué)研究邁入了嶄新的時代。




實驗流程：


技術(shù)特點：
· 更快的速度，大于 120 Hz MS/MS，是實際樣本分析掃描速度最快的質(zhì)譜儀。
· 更高的靈敏度，利用離子淌度在時間和空間進行聚焦，使靈敏度提高了20倍，對微量樣品適應(yīng)性好。
· 更高的專屬性，與傳統(tǒng)3D質(zhì)譜相比增加了離子淌度這一維度，可對待測蛋白進行四維鑒定和定量分析，提高譜圖可靠性。
· 更高的峰容量，通過離子淌度維度的加入使峰容量增加了10倍，能鑒定到更多的蛋白組。
· 在任何速度下均能保持高分辨率。
· 性能穩(wěn)定，耐臟，重現(xiàn)性好。
· 實時數(shù)據(jù)庫檢索引擎（PaSER）的應(yīng)用讓數(shù)據(jù)采集和檢索同步進行，節(jié)省數(shù)據(jù)分析時間。

產(chǎn)品分類：
    4D-labelfree,不需要對樣品進行任何標記，每個樣品可單獨上機。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，獲得蛋白質(zhì)表達量變化情況，對蛋白進行定性定量分析。
    4D-labelfree修飾蛋白檢測，富集修飾蛋白進行鑒定及定量研究，可分析蛋白磷酸化、乙酰化等各種修飾組學(xué)，獲得修飾程度信息。
    4D-DIA，與Labelfree同屬于非標記蛋白組學(xué)技術(shù)，但使用DIA采集模式替代DDA采集模式，不涉及對肽段的限制性篩選，因此具有更好的定量準確性，適用于復(fù)雜體系、海量樣品的差異檢測。
    4D-Super Blood dDIA，通過生物磁珠去除高峰度蛋白，突破物種和蛋白種類的限制，同時通過分析分子量和離子淌度的相關(guān)性，并搭配新的DIA數(shù)據(jù)采集模式，從而鑒定到更多的蛋白質(zhì)種類，為血液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了完美的解決方案。
    4D-Trace Sample dDIA，通過分析分子量和離子淌度的相關(guān)性，搭配剛新的DIA數(shù)據(jù)采集模式，從而可以鑒定到更多的蛋白質(zhì)種類，更加具有微量樣本檢測優(yōu)勢，為科研用戶對極難獲得的珍貴樣本的研究提供了保證。
    4D-外泌體蛋白組，通過增加第四個維度--離子淌度（mobility）結(jié)合TIMS/PASEF® (Parallel Accumulation - Serial Fragmentation平行累積串行碎裂)分離技術(shù)，并搭配新的DIA數(shù)據(jù)采集模式，大幅度地提高了掃描速度以及蛋白鑒定的數(shù)量和覆蓋率，為外泌體樣本研究提供了保證。
    4D-PRM，是可對目標蛋白質(zhì)（或肽段）進行絕對定量分析的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，用于驗證大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)幾十個到上百個蛋白質(zhì)的定量結(jié)果，通量高，靈敏度好。

應(yīng)用場景：
    微量樣品，離子淌度的應(yīng)用帶來了更高的靈敏度和專屬性，極大的提高了微量樣品（如FFPE、穿刺樣品等）的蛋白檢出數(shù)和準確性。
    大隊列樣品研究，極快的掃描速度、耐臟和高穩(wěn)定性是大隊列樣品蛋白質(zhì)組學(xué)研究的保障。
    修飾組學(xué)，離子淌度能更好的區(qū)分同分異構(gòu)體，可更有效地區(qū)分具有相同質(zhì)荷比但修飾位點不同的修飾蛋白質(zhì)。

測試結(jié)果：

研究思路：


應(yīng)用案例：非小細胞肺癌的蛋白質(zhì)基因組學(xué)揭示了與特定治療靶點和免疫逃避機制相關(guān)的分子亞型

影響因子：23.177；發(fā)表時間：2021.11；發(fā)表期刊：Nature cancer

研究者對141例非小細胞肺癌(NSCLC)的所有主要組織學(xué)進行了深入的基于質(zhì)譜（TMT）的蛋白質(zhì)基因組分析。他們確定了6種不同的蛋白質(zhì)組亞型，并發(fā)現(xiàn)在免疫細胞組成和免疫檢查點的亞型特異性表達方面存在顯著差異。出乎意料的是，在免疫冷亞型中，高新抗原負擔與全局低甲基化和復(fù)雜的新抗原定位到基因組區(qū)域(如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元素和內(nèi)含子)有關(guān)。此外，他們通過STK11突變依賴的HNF1A激活和FGL1表達將免疫逃避與LAG-3聯(lián)系起來。最后，他們開發(fā)了一種獨立數(shù)據(jù)采集質(zhì)譜的NSCLC亞型分類方法，在208例NSCLC病例的獨立隊列中驗證了該方法，并通過分析84例晚期NSCLC活檢標本證明了其臨床應(yīng)用價值。

實驗設(shè)計（a，b）和蛋白聚類結(jié)果（c）


抑制性受體及其配體的蛋白水平