載體介導(dǎo)的RNAi（shRNA)

siRNA設(shè)計
有效的siRNA是基因沉默成功與否的關(guān)鍵，并非每個siRNA都能有效地引發(fā)基因沉默。關(guān)于siRNA設(shè)計，可以參考以下設(shè)計原則：
（1）每次設(shè)計的siRNA建議設(shè)計3-5個，可以增加成功的概率；
（2）siRNA的序列長度建議在19-21nt；
（3）siRNA序列的GC含量建議占比30%-50%。

1. 設(shè)計的siRNA避免與其他基因同源，避免沉默到別的基因；

（5）多個設(shè)計的siRNA盡量分散在mRNA的全長。多個分散的位點可以避免mRNA的二級結(jié)構(gòu)或蛋白結(jié)合而影響siRNA對目的mRNA的結(jié)合，分散設(shè)計可以降低風(fēng)險。
（6）siRNA的反義鏈最好以UU結(jié)尾，這是被公認(rèn)的最有效的結(jié)構(gòu)。
即在設(shè)計siRNA時，先掃描mRNA上的所有AA二核苷酸，并選擇AA二核苷酸往3’端方向的17-19個核苷酸。

shRNA設(shè)計
shRNA可由正義鏈的siRNA通過一段端的間隔序列與反義鏈siRNA相連，在核苷酸的末端增加5-6個T組成。簡而言之，shRNA是由兩個短反向重復(fù)序列，中間一莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由5-6個T組成RNA pol Ⅲ終止位點。關(guān)于其設(shè)計，除了需要遵循以上siRNA設(shè)計原則外，還需要注意以下幾點：
（1）由兩個短反向重復(fù)序列，中間一莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，需加上5-6個T組成RNA pol Ⅲ終止位點；
 
（2）兩端需要加上限制性酶切位點，方便與載體連接；
（3）最常見的頸環(huán)結(jié)構(gòu)序列為5’-TCAAGAG-3’
（4）目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，如果涉及的序列不是以G開頭，則需要加上一個G;
（5）不能出現(xiàn)3個以上的T。