RACE服務(wù)

RACE服務(wù)

服務(wù)簡(jiǎn)介

RACE是基于PCR技術(shù)由已知的部分cDNA順序來(lái)獲得完整cDNA5′和3′端的方法。分離和克隆基因是研究基因結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)的基礎(chǔ)，通過(guò)建立和篩選cDNA文庫(kù)來(lái)分離克隆目的基因的經(jīng)典方法繁瑣而且工作量大，而RACE則可以簡(jiǎn)單而有效的從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA末端，從而獲得目的基因全長(zhǎng)cDNA序列。Invitrogen采用GeneRacer 試劑盒確保只有5’具有帽子結(jié)構(gòu)，3’具有polyA全長(zhǎng)cDNA才能擴(kuò)增。

RACE原理

要獲得cDNA3′末端, 以O(shè)ligodT錨定引物為引物反轉(zhuǎn)錄總RNA得到cDNA，接著用SP5和PCR錨定引物進(jìn)行PCR循環(huán)即可擴(kuò)增得到cDNA鏈。擴(kuò)增的特異性取決于SP5的堿基與目的cDNA分子互補(bǔ)。要獲得cDNA5′末端，利用基因特異性引物SP1反轉(zhuǎn)錄總RNA, 分離反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)加上poly(A)尾。以d(T)錨定引物和位于延伸引物序列上游的基因特異性擴(kuò)增引物SP2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。再用PCR錨定引物和特異性巢式引物SP3進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，進(jìn)行測(cè)序。最后,從兩個(gè)有相互重疊序列的3′和5′RACE產(chǎn)物來(lái)獲得全長(zhǎng)cDNA,或者通過(guò)分析RACE產(chǎn)物的3′和5′末端順序,合成相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來(lái)獲得。

服務(wù)流程

1、總RNA提取

2、已知序列驗(yàn)證：依據(jù)客戶(hù)提供的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，驗(yàn)證參考序列的存在及方向

3、5’和3’RACE

4、對(duì)獲取的序列進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證

客戶(hù)提供

材料要求新鮮、RNA不能降解，總RNA樣品不少于10μg

服務(wù)結(jié)果

1、構(gòu)建好5’和3’RACE的TA克隆

2、產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜，產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

3、詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程及反應(yīng)條件

服務(wù)質(zhì)量

獲取的5’和3’RACE序列與已知序列連續(xù)存在于同一條cDN**段上。