Car-T與單抗藥靶特異性鑒定—IND申請(qǐng)

       眾所周知，單克隆抗體藥物和CAR-T/CAR-NK治療已經(jīng)成為生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的新寵，然而，伴隨而來的即是全球醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)之間激烈的競(jìng)爭(zhēng)。據(jù)國際抗體協(xié)會(huì)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)截止到今年2月份，美國的在研單抗藥物數(shù)量達(dá)到了760多個(gè)，其中上市的有94個(gè)單抗藥物，并且有17個(gè)單抗藥物處在審批階段。中國在研單抗藥物數(shù)量超過350個(gè)，其中國內(nèi)上市的有28個(gè)，而根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前國產(chǎn)單抗藥物只有13種�？梢妵�際單抗藥物的研發(fā)競(jìng)爭(zhēng)態(tài)勢(shì)異常激烈，加快單抗藥物研發(fā)進(jìn)程對(duì)于我國在該領(lǐng)域建立戰(zhàn)略性優(yōu)勢(shì)具有重大意義。

 

 

 

圖1 在研藥物脫靶情況分析

       在Integral Molecular公司鑒定的這些抗體中，既有在臨床II期實(shí)驗(yàn)比較順利，并被大型藥企高額收購的單抗；也有因?yàn)橹滤佬愿弊饔帽唤型Ｍ顺雠R床研究的單抗。通過MPA膜蛋白芯片技術(shù)的檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)了這些抗體的多特異性問題（圖2）。如果有好的技術(shù)手段能夠在研究階段就確定單抗藥物是否具有多特異性的問題，那么無論對(duì)于藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)還是對(duì)于收購藥物的公司來說，都將避免巨大的資源浪費(fèi)和公司市值的動(dòng)蕩。同時(shí)，對(duì)于病人來說，也減少了面對(duì)“生與死”的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 單抗藥物脫靶鑒定經(jīng)典案例

|   單抗藥物特異性鑒定策略

       單抗藥物等大分子藥物主要針對(duì)細(xì)胞膜蛋白，如PD-L1、PD-1和 CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)設(shè)計(jì)，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，如免疫組化、流式等技術(shù)，要么分辨率不夠，要么通量太小。普通的蛋白純化技術(shù)很難表達(dá)純化，并維持正確構(gòu)象。Integral Molecular公司現(xiàn)任CEO Ben Doranz博士等6名資深專家創(chuàng)造性地開發(fā)了將5300余種膜蛋白（涵蓋了人類94%的膜蛋白，包含所有的蛋白質(zhì)類別，例如單次跨膜、多次跨膜和GPI錨定蛋白）表達(dá)于384孔板培養(yǎng)的活細(xì)胞表面的技術(shù)，即膜蛋白質(zhì)組芯片（Membrane Proteome Array，MPA）技術(shù)。而將膜蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜的表面，由于擁有磷脂雙分子層的立體支撐，膜蛋白就能夠保持正確的空間構(gòu)象（圖3），進(jìn)而能夠完成一系列基于膜蛋白的科學(xué)研究。而這些膜蛋白正是大分子抗體藥物的主要作用靶點(diǎn)，或毒副作用的靶點(diǎn)。

       圖3 MPA膜蛋白質(zhì)組芯片示意圖

       由于MPA膜蛋白質(zhì)組芯片技術(shù)完美解決了膜蛋白篩選和鑒定的諸多難題，一經(jīng)推出，便在抗體研究領(lǐng)域引發(fā)了強(qiáng)烈反響，迅速成為單抗藥物靶點(diǎn)特異性鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，受到國內(nèi)外IND評(píng)審專家的一致推薦。截止目前，Integral Molecular公司先后已經(jīng)為超過400家醫(yī)藥企業(yè)和科研院所，推進(jìn)過2000+單抗藥物研究項(xiàng)目。在Nature、Cell、Science等頂級(jí)期刊發(fā)表的文獻(xiàn)已經(jīng)超過250篇（圖4）。

 圖3 MPA膜蛋白質(zhì)組芯片應(yīng)用現(xiàn)狀

|   單抗藥物特異性鑒定策略

       MPA的實(shí)驗(yàn)過程是將總量不超過500ug的抗體藥物逐孔加入384孔板中，通過流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定抗體藥物是否與細(xì)胞膜上的膜蛋白產(chǎn)生結(jié)合，并對(duì)陽性結(jié)果通過量化滴定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。MPA膜蛋白質(zhì)組芯片實(shí)驗(yàn)流程非常嚴(yán)謹(jǐn)，需分三個(gè)階段逐步開展：

      第一階段，客戶需提供單抗藥物的目標(biāo)靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將抗體分為4個(gè)濃度與表達(dá)有膜蛋白的細(xì)胞進(jìn)行孵育，利用高通量免疫熒光流式檢測(cè)抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合情況，以篩選第二階段正式實(shí)驗(yàn)最佳上樣濃度，并確定陰性對(duì)照的假陽性率。第二階段，將抗體采用第一階段選定的最佳濃度與384孔板中的細(xì)胞進(jìn)行孵育，利用高通量免疫熒光流式檢測(cè)抗體與哪些孔中的細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)合信號(hào)，通過獨(dú)特的交叉孔排列組合驗(yàn)證的方式進(jìn)行假陽性結(jié)合信號(hào)的排除，獲取陽性結(jié)合蛋白列表。第三階段，對(duì)細(xì)胞膜蛋白芯片篩選出的結(jié)合蛋白，采用一對(duì)一驗(yàn)證的方式再次確認(rèn)陽性結(jié)合。驗(yàn)證通過標(biāo)準(zhǔn)：被驗(yàn)證的靶點(diǎn)與抗體結(jié)合能夠呈現(xiàn)濃度梯度關(guān)系，并且最高的兩個(gè)濃度的MFI熒光值 至少超過背景的 2 倍以上。以上嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合豐富的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，既達(dá)到了獲得高檢測(cè)靈敏度的要求，又排除了假陽性結(jié)果的干擾。

|   服務(wù)資質(zhì)     

       華盈生物作為 Integral Molecular 公司 MPA膜蛋白組芯片技術(shù)在中國大陸認(rèn)證服務(wù)商，長(zhǎng)期致力推廣該技術(shù)在新興免疫治療藥物研發(fā)階段的廣泛應(yīng)用。截止目前，華盈生物已經(jīng)為多家中國大陸單抗藥物研發(fā)企業(yè)研發(fā)產(chǎn)品通過IND申報(bào)提供了關(guān)鍵質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)。相信隨著MPA細(xì)胞膜蛋白組芯片技術(shù)的幫助，國內(nèi)大分子藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)的IND申報(bào)速度將會(huì)得到質(zhì)的提升，進(jìn)一步提高在全球醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的競(jìng)爭(zhēng)力。

|   相關(guān)文獻(xiàn)

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