按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明書操作步驟提取核蛋白。
使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。
| 試劑 |
濃度6.5％ |
| H2O ml |
6.8 |
| 5*TBE ml |
1 |
| 40％丙烯酰胺（37.5：1）ml |
1.65 |
| 50%甘油 ul |
500 |
| 10％AP ul |
100 |
| TEMED ul |
10 |
| 總體積 ml |
10 |
待膠完全凝固后100v預(yù)電泳1h，緩沖液用預(yù)冷的0.5×TBE。
| 試劑名稱 |
體積 |
| 10×binding buffer |
2ul |
| 1ug/ul poly（dl.dc） |
1ul |
| 50％glycerol |
1ul |
| 1%NP-40 |
1ul |
| 100m M Mgcl2 |
1ul |
| 核蛋白（unit） |
陰性對(duì)照反應(yīng)：0
陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)：1
冷探針競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：1
常規(guī)反應(yīng)：1 |
| DNA(pmol/ul) |
陰性對(duì)照反應(yīng)：0 ul
陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)：0 ul
冷探針競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：1 ul
常規(guī)反應(yīng)：0 ul |
| BIO-DNA(fmol/ul) |
陰性對(duì)照反應(yīng)：1 ul
陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)：1 ul
冷探針競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：1 ul
常規(guī)反應(yīng)：1 ul |
| 總體積 |
ddH2O 補(bǔ)足至20ul |
混合后室溫放置20分鐘或以上。
預(yù)電泳完后更換預(yù)冷的電泳緩沖液，加5ul的5×上樣緩沖液到樣品混合液中，馬上上樣電泳。150v 30－45分鐘。
將帶正電的尼龍膜放入0.5×TBE中平衡10分鐘。待電泳完成后將加有樣品的整塊膠取下電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜緩沖液為預(yù)冷的0.5×TBE。380m A 30分鐘。
轉(zhuǎn)膜完成后將膜取出，放在一張干凈的濾紙上，做好標(biāo)記。于紫外交聯(lián)儀下交聯(lián)10min。
用封閉液封閉15分鐘。期間放于搖床上輕柔搖晃。
倒掉封閉液。用封閉液將抗體稀釋300倍后，與膜完全作用15分鐘。期間放于搖床輕柔搖晃。
用1×的洗脫液清洗5分鐘4次。
用平衡液平衡5分鐘。
1） 滴加新鮮配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)�，暗室中曝光�?br />
2） 根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。
將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。 |
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