動物實(shí)驗(yàn)平臺——基因型鑒定

基因型(genotype)是指一個生物體內(nèi)細(xì)胞 DNA所包含的與某個性狀相關(guān)的基因類型。主要通過PCR和Southern blotting分析來鑒定基因修飾動物的基因型。PCR反應(yīng)為常規(guī)方法，轉(zhuǎn)基因動物有時需要用Southern blotting驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。用Southern blotting還可以確定轉(zhuǎn)基因是否發(fā)生重排或刪除�；�因發(fā)生重排時，會導(dǎo)致酶切位點(diǎn)發(fā)生變化，產(chǎn)生不同的酶切圖譜。用實(shí)時定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)可快速確定轉(zhuǎn)基因mRNA表達(dá)量。

轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入動物基因組，如果轉(zhuǎn)基因動物沒有異常，通常不需要確定轉(zhuǎn)基因整合位置；如需測定，可以通過熒光原位雜交在顯微鏡下直接觀察整合位置和局部染色體結(jié)構(gòu)。這項(xiàng)技術(shù)還可以用于檢測轉(zhuǎn)基因插入部位的染色體重排以及由Cre重組酶誘導(dǎo)的局部染色體刪除。

PCR反應(yīng)基因型鑒定的原理是首先設(shè)計(jì)能與引入的外源基因結(jié)合的特異性引物，擴(kuò)增原本不存在于動物基因組中的DNA序列。引物的設(shè)計(jì)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)基因動物基因型分析的引物通常位于轉(zhuǎn)基因內(nèi)，一般選擇特異性的DNA序列作為引物以確定轉(zhuǎn)基因是否存在。在多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)基因的插入位點(diǎn)是未知的，難以設(shè)計(jì)引物以確定轉(zhuǎn)基因是否為純合子或雜合子。

對于基因敲除和基因敲入動物，由于明確知道基因修飾的位置，因此，可以設(shè)計(jì)野生型和突變型的引物以確定基因型是否為純合子或雜合子。突變型引物對：一個引物位于同源重組短臂外；另一個位于引入的外源基因，如Neo基因內(nèi)。野生型引物通常位于要敲除的DNA序列。突變型和野生型PCR產(chǎn)物的大小應(yīng)不同，在100～700bp之間，足以用凝膠電泳區(qū)別鑒定。引物的GC比例約為50％(40％～60％)。基因型分析時還要注意設(shè)立對照組。PCR反應(yīng)陽性對照：可選內(nèi)源性看家基因如β-actin，以確定DNA質(zhì)量和正確的擴(kuò)增反應(yīng)體系。每個DNA樣本的PCR反應(yīng)都應(yīng)為陽性。陰性對照：通常指用水代替DNA模板的對照組，以排除污染和假陽性。

實(shí)驗(yàn)過程：提取基因修飾動物的DNA、用PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶序列、瓊脂糖凝膠電泳、檢測DNA片段的有無和大小以確定基因型。從活體組織中分離基因組DNA，小鼠的活體解剖組織可以是一小片尾或耳組織。轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定可以只用一對特異性引物進(jìn)行分析，結(jié)果為陽性(+)或陰性(-)：陽性表示有轉(zhuǎn)基因，陰性表示沒有轉(zhuǎn)基因。基因敲除或基因敲入小鼠的基因型鑒定通常需要設(shè)計(jì)兩對引物。一對引物擴(kuò)增野生型，另一對引物擴(kuò)增突變型�；�因型鑒定結(jié)果有三種情況：野生型用+表示，突變型用-表示。+/-為基因敲除雜合子，+/+為野生型小鼠，-/-為基因敲除純合子。