制作石蠟切片,切片前須將石蠟滲透組織包埋于石蠟中,而水與石蠟又是不相混合的,所以在浸蠟,包埋前必須將組織內(nèi)所含的水分脫去。而大多數(shù)的組織固定劑是水溶液,隨后的水沖洗也使其含有大量水分,因此必須先行脫水,一般是浸入逐級(jí)增加濃度的酒精來完成。由于酒精和石蠟不能混合,須再用一種石蠟的溶劑來置換酒精,因大多數(shù)石蠟溶劑有使組織的折光率增高并表現(xiàn)為透明或半透明狀,所以此步驟又稱透明。最后用石蠟浸漬組織并鑄制成堅(jiān)實(shí)的蠟塊。常規(guī)的石蠟包埋過程包括五個(gè)基本步驟,即固定,脫水,透明,浸蠟和包埋。
材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量,無論取哪一種動(dòng)植物材料,必須注意植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分;動(dòng)物材料取用時(shí)將動(dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織。
冰凍切片(frozen section)是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度,然后進(jìn)行切片的方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡(jiǎn)便,而多應(yīng)用于手術(shù)中的快速病理診斷。冰凍切片的種類較多,有低溫恒冷箱冰凍切片法,二氧化碳冰凍切片法,甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。
操作方法及步驟:
①取材,未能固定的組織取材,不能太大太厚,厚者冰凍費(fèi)時(shí),大者難以切完整,最好為24×24×2mm。
②取出組織支承器,放平擺好組織,周邊滴上包埋劑,速放于冷凍臺(tái)上,冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器,滴上包埋劑讓其冷凍,形成一個(gè)小臺(tái)后,再放上細(xì)小組織,滴上包埋劑。
③將冷凍好的組織塊,夾緊于切片機(jī)持承器上,啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵,轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕,將組織修平。
④調(diào)好欲切的厚度,根據(jù)不同的組織而定,原則上是細(xì)胞密集的薄切,纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切,一般在5~10um間。
⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片,關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上,這就要求操作者要細(xì)心,準(zhǔn)確地將其調(diào)較好,調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢谩G衅瑫r(shí),切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過刀防卷板間的通道,平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板,取一載玻片,將其附貼上即可。
⑥應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低,主要根據(jù)不同的組織而定,不能一概而論。如:切未經(jīng)固定的腦組織,肝組織和淋巴結(jié)時(shí),冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低,在-10- -15℃左右,切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí),可調(diào)在-15~20℃左右,切帶脂肪的組織時(shí),應(yīng)調(diào)至-25℃左右,切含大量的脂肪時(shí),應(yīng)調(diào)至-30℃。
冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng):
①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈,需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過和附貼的地方,如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上,將會(huì)破壞甚至撕裂切片,便切片不能完整切出。
②多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí),可各自放于不同的支承器上,于冷凍臺(tái)上凍起來,然后依據(jù)不同的編號(hào),依序切片,這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂。
③放置組織冰凍前,應(yīng)視組織的形狀及走勢(shì)來放置,所謂“砍柴看柴勢(shì)”,切片也是如此,如果胡亂放置,就不能收到很好的效果。
④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定,尤其是含水的固定液,在未達(dá)到固定前,更不能使用。臨床快速冰凍切片,不須要預(yù)先固定,一是為了爭(zhēng)取時(shí)間,二是固定了的組織,反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片,就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前,其中的水份也可滲入到組織中去,當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí),這些水份就存留于組織中,形成了冰晶。
⑤當(dāng)切片時(shí),如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時(shí),可將冰凍的組織連同支承器取出來,在室溫停留片刻,再行切片,或者用口中哈氣,或者用大拇指按壓組織塊,以此來軟化組織,再行切片。另者,調(diào)高冰凍點(diǎn)。
⑥用于附貼切片的載玻片,不能存放于冷凍處,于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí),從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差,當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí),由于兩種物質(zhì)間溫度的差別,當(dāng)它們碰撞在一起時(shí),分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力,使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片,由于溫度相同,沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。
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