microRNA載體構(gòu)建

microRNA簡介
microRNA（miRNA）是一類內(nèi)生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個miRNA來調(diào)控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNAs的組合來精細調(diào)控某個基因的表達。隨著miRNA調(diào)控基因表達的研究的逐步深入，將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復(fù)雜性和復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
葉民生物為您提供microRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)，您只需提供您要做的目的基因序列及ID號，本公司專業(yè)的技術(shù)人員為您完成microRNA靶位點序列設(shè)計分析、及microRNA載體構(gòu)建；

microRNA載體構(gòu)建的特點及優(yōu)點：
1. 超過70%成功阻斷：利用BLOCK-It RNAi Designer設(shè)計軟件，可快速高效地設(shè)計、克隆出雙鏈寡核苷酸序列，構(gòu)建出含Pol II啟動子啟動的用于RNAi分析的載體，用于RNAi分析，100%保證提供不少于70%的有效阻斷（當(dāng)以50nM轉(zhuǎn)染，而且轉(zhuǎn)染效率至少達80%時，一套中3條RNAi中至少有2條達到至少70%轉(zhuǎn)錄的阻斷）；
2. 簡單的表達跟蹤：可通過同-順反子表達Emerald Green Fluorescent Protein(EmGFP)和目的microRNA (miRNA)使得分析簡單以及報告因子活性與阻斷之間可靠的相關(guān)性
3. 多靶標(biāo)阻斷：同-順反子（Co-cistronic）表達使得多個靶標(biāo)同時阻斷并且產(chǎn)生綜合表現(xiàn)型。
4. 組織特異實驗選擇：通過選擇廣泛的目的載體或者Multisite Gateway應(yīng)用，你可以加入你選擇的啟動子進行細胞內(nèi)應(yīng)用或者體內(nèi)阻斷，在哺乳動物細胞中可進行瞬時或永久的microRNA表達；

microRNA載體構(gòu)建技術(shù)服務(wù)流程：
1.microRNA靶點的預(yù)測
利用軟件得到的目的microRNA的預(yù)測靶點。
2.獲得microRNA對應(yīng)DNA模板
根據(jù)提供的靶序列，合成兩條互補的單鏈DNA模板�；蛘�，設(shè)計引物PCR擴增microRNA靶基因3’UTR序列。
3.microRNA靶序列克隆
將合成的兩條單鏈退火成雙鏈（具有粘性末端），或?qū)�PCR產(chǎn)物雙酶切，后連入經(jīng)過同樣雙酶切的miR-reporter載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
4.陽性克隆鑒定。
挑選轉(zhuǎn)化的菌落，PCR篩選含有插入片段的陽性克隆，測序驗證克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.準(zhǔn)備質(zhì)粒，菌株
抽提驗證正確的質(zhì)粒，定量。準(zhǔn)備含有正確質(zhì)粒的單克隆甘油菌株。
6.產(chǎn)品包裝，發(fā)貨
提供有microRNA靶序列的報告質(zhì)粒，并免費提供陰性對照一份。甘油保存菌株各一支。