Apoe小鼠基因敲除apoe小鼠構(gòu)建基因打靶的原則是, 外源DNA 片段含有與目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列, 同源重組就發(fā)生在這兩個序列之間。基因敲除小鼠外源DNA 序列的定位整合有兩種方式, 即插入型(又稱O 型) 和置換型(又稱8 型)。與此相對應(yīng), 基因敲除小鼠構(gòu)建打靶載體可分為兩類: 插入型載體和置換型載體。
同源重組方法(及基因敲除小鼠)
如果研究者想用基因工程載體代替其等位基因,同時又不會對基因組上的其他基因造成任何影響,那么最好的選擇就是進行同源重組。要進行這一操作,首先要知道靶基因的DNA序列(如圖1)。有了這一信息,用你的目標序列替換任何靶基因就都成為可能。關(guān)于同源重組的方法,除本章圖解外還有更多的細節(jié),這里只介紹基本的原理。
基因敲除小鼠構(gòu)建需要被基因工程載體所替代的靶基因圖譜。編碼序列由方框標出,其上下游側(cè)翼DNA序列也被標明。由靶基因向兩側(cè)延伸的箭頭代表染色體上其他的連續(xù)DNA序列。
基因敲除小鼠構(gòu)建接下來的步驟就是設(shè)計并構(gòu)建DNA載體,用以插入并替代染色體上的等位基因。這一載體可以包含你所選擇的任何DNA序列,用來將不同的等位基因,即研究者所要插入的目標序列(編碼區(qū)或非編碼區(qū)均可)或報告基因(例如:抗生素抗性基因或綠色熒光蛋白)插入基因組中。但不論插入哪種序列,都需要包含一些與靶基因上下游側(cè)翼序列一致的DNA序列(如圖2).除了陽性篩選標記(例如抗生素抗性基因),通常還需要在載體中加入陰性篩選標記(例如胸苷激酶,tk)。通常陰性標記位于載體上與靶基因同源的序列之外。
基因敲除小鼠構(gòu)建用于同源重組的基因工程載體圖譜。取代序列的上下游側(cè)翼序列與靶基因的上下游側(cè)翼序列一致。陰性篩選標記tk位于載體上與靶基因同源的序列下游。
基因敲除小鼠構(gòu)建基因工程載體被加入到包含靶基因的細胞中。其替代等位基因的機理還不完全清楚,但是與細胞減數(shù)分裂和有絲分裂中同源染色體在細胞板處聯(lián)會非常相似,基因工程載體能夠找到靶基因并在與之相同的DNA序列處發(fā)生同源重組(如圖3)。這種重組可能發(fā)生在二者相同側(cè)翼序列的任何位置,但具體位置則由細胞本身決定,而不是人工能夠控制的。
基因敲除小鼠構(gòu)建同源重組發(fā)生前的載體與靶基因。令人驚奇的是,載體自身能夠進入細胞核并與靶基因并排排列。這種排列的機制尚不清楚,但是在某些物種中,這種排列的確比其他物種中的更完美,酵母就是其中之一。小鼠是用于同源重組的較好的哺乳動物系統(tǒng),但是其中重組發(fā)生的效率不如人類細胞高。
細胞發(fā)生同源重組后,新的DNA片段即目標序列被插入了基因組中。其中只是靶基因及其上下游的一些側(cè)翼序列被載體中同源的部分所取代,基因組的其他部分并不受到影響(如圖4)。在載體與靶基因發(fā)生重組后,最初的靶基因序列被交換到了載體上。由于載體不能夠在細胞核中獨立地進行復(fù)制,因此隨著細胞的分裂很快就丟失了。而被替代后的基因組則忠實地進行自我復(fù)制,此時新插入的目標序列也就得以復(fù)制了。
發(fā)生了同源重組的細胞(帶有陽性篩選標記)可以用加入了特定抗生素的培養(yǎng)基篩選出來。需要注意的是,陰性篩選標記并沒有通過同源重組整合到染色體中。
基因敲除小鼠構(gòu)建同源重組發(fā)生后的產(chǎn)物。此時染色體上的靶基因被載體攜帶的目標序列所取代,同時還包括一些與載體一致的側(cè)翼序列。而靶基因則被交換到載體上,隨著細胞的分裂而丟失。自此,插入到基因組中的目標序列就會像其他所有序列一樣,隨著基因組的復(fù)制而被忠實地復(fù)制。
如果載體與基因組上的非同源區(qū)域并排排列,就可能發(fā)生任意的非同源重組,此時載體上攜帶的陰性選擇標記就會被整合到基因組中(如圖5)。
非同源重組發(fā)生前的載體與靶基因。此時發(fā)生的重組是任意的。需要注意的是,在這種情況下,陰性篩選標記被整合到了基因組中。
發(fā)生了非同源重組的細胞(如圖6)在陽性篩選標記的特定抗性培養(yǎng)基中能夠存活。但是,有一種藥物叫做更昔韋洛(gancyclovir),能夠殺死任何攜帶有tk基因的細胞。因此,發(fā)生了同源重組的細胞就可以在抗生素與更昔韋洛同時存在的培養(yǎng)基中存活,而發(fā)生了非同源重組的細胞則會被更昔韋洛殺死。
非同源重組發(fā)生后的產(chǎn)物。陽性和陰性篩選標記同時進入細胞染色體,因此更昔韋洛能夠殺死發(fā)生了非同源重組的細胞。