二代測(cè)序NGS的常見問(wèn)題及解答之基礎(chǔ)篇（一）

隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，眾多測(cè)序手段現(xiàn)已走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，成為科學(xué)家的科研利器，第二代DNA測(cè)序技術(shù)又稱下一代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)是目前應(yīng)用廣泛的測(cè)序手段之一，下面我們通過(guò)一些普遍的問(wèn)題來(lái)慢慢了解它。

Q：什么樣本可以做NGS測(cè)序分析？
A:NGS實(shí)驗(yàn)不挑樣本，動(dòng)物、植物、微生物等具有遺傳信息的物種都可以進(jìn)行NGS測(cè)序?qū)嶒?yàn)分析，但是需要老師根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和需求來(lái)選擇測(cè)序樣本類型和檢測(cè)項(xiàng)目。

Q：我們進(jìn)行分析時(shí)使用的參考基因組是怎么來(lái)的？
A:通過(guò)Denovo測(cè)序(也就是從頭測(cè)序)得到數(shù)據(jù)，然后拼接得到基因組序列，再通過(guò)不斷的完善和功能注釋，給到我們現(xiàn)在使用。

Q：什么是重測(cè)序Resequencing？
A:待測(cè)物種如果有發(fā)表過(guò)的參考基因組，重新進(jìn)行測(cè)序就不需要拼接，可以直接對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行短序列比對(duì)。簡(jiǎn)而言之就是對(duì)基因組序列已知的物種個(gè)體進(jìn)行基因組重新測(cè)序，本質(zhì)就是找變異。所以我們的重測(cè)序項(xiàng)目下機(jī)數(shù)據(jù)都是不拼接的。

Q：什么是測(cè)序深度，與基因覆蓋度是一回事嗎?
A:測(cè)序深度（Sequencing Depth）是指：測(cè)序得到的堿基總量（bp）與基因組（轉(zhuǎn)錄組或測(cè)序目標(biāo)區(qū)域大小）的比值，是評(píng)價(jià)測(cè)序量的指標(biāo)之一。例如：人類全基因組大約3G，測(cè)序深度30×的話，即獲得3×30=90G的數(shù)據(jù)量；覆蓋度（coverage）是指測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測(cè)序最終拼接組裝獲得的序列往往無(wú)法覆蓋所有的區(qū)域，這部分未覆蓋的區(qū)域就稱為Gap。

Q：重測(cè)序要求測(cè)序深度，是越多越好嗎?大約多少×合適？
A:測(cè)序深度當(dāng)然是越多越好，但是考慮到芯片大小以及資源浪費(fèi)的問(wèn)題，一般推薦10-30×，適用于有參物種，根據(jù)分析需求不同，選擇合適的深度測(cè)序(SNP/InDel >10×; SV > 20×; CNV > 30×, 轉(zhuǎn)座子> 20×)，增加測(cè)序深度可以提高基因組覆蓋度和變異檢出率。

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