DNA測序技術(shù)的現(xiàn)狀和發(fā)展（上）

注：蜜蜂群崩潰癥（honeybee colony collapse），指的是來自養(yǎng)蜂業(yè)的蜂箱或自然界存在的歐洲蜜蜂群的工蜂突然消失的現(xiàn)象，又稱作Colony collapse disorder（CCD)。

1.1.3.2 模板制備程序

完全的體外大規(guī)模模板制備工作是達成高通量、低價格測序技術(shù)的前提。已廣泛使用的乳液PCR擴增技術(shù)就是一種很好的方法。不過，由于很難在熱循環(huán)測序反應(yīng)中保證乳液微滴的穩(wěn)定性，因此最開始實驗的模板擴增方法是恒溫擴增法（isothermal）。
乳液PCR不需要借助細(xì)菌的幫助就能擴增模板，雖然這一點非常誘人，但最開始時并沒有合適的表面活性劑能幫助乳液在熱循環(huán)過程中保持穩(wěn)定。于是出現(xiàn)了恒溫擴增法，即滾環(huán)擴增反應(yīng)（RCA）。雖然滾環(huán)擴增反應(yīng)的產(chǎn)量非常高，但這些產(chǎn)物中大部分都不能用來作為測序模板。因此，還需要找到一種不需要細(xì)菌擴增，能用于有限稀釋的模板擴增新方法。于是，人們又把目光轉(zhuǎn)回了PCR法。在RCA法中，首先將模板克隆有限稀釋之后置入光纖玻片上的小孔中，然后用橡膠襯墊把光 纖玻片封閉起來，將玻片放入傳統(tǒng)的平頂PCR儀進行擴增。這種方法取得了成功，但是效率不高，因為在玻片中的熱質(zhì)量（thermal mass）和它的鉗效應(yīng)（clamping mechanism）需要更長的PCR循環(huán)時間，而且模板的有限稀釋度不能低于10%�？着c孔之間的相互污染現(xiàn)象也是一個不容忽視的問題。不過無論如何，該方法還是第一個首先從全基因組文庫中擴增模板然后使用非Sanger、非Gilbert測序法對基因組進行從頭測序的方法，也是第一個使用體外模板擴增 技術(shù)進行全基因組（腺病毒基因組）測序的方法。

乳液滴的熱穩(wěn)定性問題最終通過加入用于制造炸藥的表面活性劑得到了解決，于是乳液PCR技術(shù)馬上在眾多新一代測序儀中得到了廣泛的應(yīng)用。因為乳液 PCR技術(shù)具有高效性、可擴展性，既能從30Kb的腺病毒基因組中擴增模板，也能從好幾Mb的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）基因組中擴增模板。

隨著測序精度、測序長度、乳液滴穩(wěn)定性等各方面技術(shù)的不斷發(fā)展，454測序儀已經(jīng)不僅僅用于對細(xì)菌級別的基因組進行測序了，還能對更高級、更復(fù)雜的生物基因組進行測序，例如現(xiàn)代人類基因組、尼安德特人基因組以及環(huán)境基因組等。

1.1.3.3 文庫制備

文庫制備包括以下幾個步驟，首先隨機切割樣品基因組，獲得大量DNA片段，然后接上接頭進行擴增反應(yīng)。454測序儀的樣品制備程序和Craig Venter等人的鳥槍法樣品制備程序有著本質(zhì)的差別。454公司采用的是如圖4中所示的有限稀釋、乳液PCR擴增法，而沒有鳥槍法中的細(xì)菌克隆繁殖步驟。去掉了細(xì)菌繁殖步驟極大地提高了整個測序工作的速度和效率，同時避免了由于細(xì)菌繁殖導(dǎo)致的序列丟失的可能性。這種方法同樣對古老DNA和代謝基因組學(xué)的研究也非常適用。末端配對文庫制備方法的建立同樣幫助454測序儀獲得了對復(fù)雜基因組從頭測序、對重復(fù)片段測序以及對基因組結(jié)構(gòu)（復(fù)制、重排）展開系統(tǒng)研究三種能力。這種末端配對文庫的制備方法是受到了Bender科研小組對果蠅（Drosophila）制備跨步文庫（jumping library）方法的啟發(fā)而發(fā)展得來的。

1.1.4 應(yīng)用范圍

隨著越來越多重要的研究領(lǐng)域受到測序技術(shù)的影響，454公司開始和其它商業(yè)和學(xué)術(shù)機構(gòu)開展合作，進行樣品測序和分析工作。這些合作項目又進一步驗證 了454測序儀使用的技術(shù)能夠在眾多領(lǐng)域中發(fā)揮作用，例如末端配對文庫技術(shù)對于研究基因組結(jié)構(gòu)的作用和乳液PCR技術(shù)捕獲目的DNA片段的作用等。

1.1.4.1 細(xì)菌基因組測序和比較基因組研究

為了測試454測序儀在全基因組測序方面的能力，454公司一開始就參與了一項合作項目，該研究項目會對4株結(jié)核分支桿菌基因組進行測序，這四株結(jié)核分支桿菌分別是一株對R207910具有耐藥性的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株，基因組大小約4Mb；兩株對R207910具有耐藥性的恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis），基因組大小約6Mb；以及一株正常的恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis），基因組大小約6Mb。他們希望能發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）對R207910產(chǎn)生抗藥性的機制。該項研究清晰的展現(xiàn)了454測序儀在測序速度和測序精度方面的優(yōu)勢。使用傳統(tǒng)的 Sanger測序法對一個4Mb的基因組和3個6Mb的基因組進行測序需要好幾個月的時間，而用454測序儀，在只有一位實驗人員參與實驗的情況下，包括樣品制備等步驟在內(nèi)所用的時間僅需要一周。而且使用454測序儀還避免了傳統(tǒng)測序方法中細(xì)菌克隆階段可能出現(xiàn)的錯誤，獲得了高質(zhì)量的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致 結(jié)核分枝桿菌對R207910產(chǎn)生抗藥性的兩個點突變位點。這項研究成果讓我們在最近的40年內(nèi)第一次找到了特異性治療結(jié)核病的藥物，同時也對454測序 儀在細(xì)菌基因組測序方面的應(yīng)用價值有了深刻的體會。隨后，454測序儀又參與了比較基因組學(xué)研究項目、對高致病性細(xì)菌空腸彎曲菌 （Campylobacter jejun）基因組的從頭測序項目、對幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）在慢性胃炎致病過程中的進化研究項目、從南極海冰細(xì)菌（Antarctic sea ice bacterium）中新發(fā)現(xiàn)冰結(jié)合蛋白（ice-binding protein）并對其測序的研究項目，以及在引起肺炎、腦膜炎和泌尿道感染的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)致病因素的研究項目等。

由于454測序儀不會因為細(xì)菌克隆產(chǎn)生測序誤差，所以在對結(jié)核分枝桿菌抗藥性的研究中表現(xiàn)出了非常強的發(fā)現(xiàn)突變位點的能力，這一點也被后來的其它研 究項目所證實。此外，最近在用454測序儀進行的人類基因組測序項目中發(fā)現(xiàn)了長達29Mb的片段與人類基因組參考序列build-36不相符，這些片段被 認(rèn)為是參考序列中不存在的序列，屬于基因組中的常染色質(zhì)部分。不過，還需要注意的是，有些報道稱由于重復(fù)片段的存在會出現(xiàn)序列組裝錯誤，而且小模板片段霧化（nebulization）處理這種方式也會造成測序錯誤出現(xiàn)。

1.1.4.2 小RNA測序

對于包括miRNA在內(nèi)的小RNA的研究興趣從2005年開始就持續(xù)不斷升溫，而2005年恰好也是454測序儀上市的那一年。454測序儀以其不 需要進行傳統(tǒng)的細(xì)菌克隆步驟和足以覆蓋只有21bp長的miRNA的測序長度等優(yōu)勢，很快就在miRNA的作用研究之中占據(jù)了一席之地。454測序儀最早 參與進行的miRNA研究是對擬南芥（Arabidopsis thaliana）miRNA開展的研究。隨后馬上又參與了另一項研究項目，在這個項目中我們在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新型的小RNA——piRNA。這些研 究項目為我們在人類、黑猩猩、斑馬魚和腫瘤細(xì)胞系中開展小RNA研究鋪平了道路。454測序儀具有的這種對小RNA進行研究的能力使它在眾多有關(guān)RNA的 研究領(lǐng)域都能有所作為，例如轉(zhuǎn)錄體研究領(lǐng)域、EST研究領(lǐng)域、5’-RATE研究領(lǐng)域和基于轉(zhuǎn)錄體的SNP研究領(lǐng)域等。

1.1.4.3 在古生物學(xué)和古DNA研究領(lǐng)域的作用

要用傳統(tǒng)的測序方法對尼安德特人的基因組進行測序研究非常困難，因為這些古老DNA量非常少，而且都早已裂解成了片段。一開始，454公司使用比較 容易得到的不太重要的古代DNA樣品檢驗了454測序儀對它們的測序能力，結(jié)果非常好，盡管當(dāng)時454測序儀的測序長度只有100bp。不過，尼安德特人 的基因組片段長度基本上都介于40bp~90bp之間，而且最近開發(fā)的乳液PCR方法也能夠?qū)ξ⒘浚▎畏肿樱�樣本進行很好的擴增。于是，454測序儀參與 了對38,000年前古老的尼安德特人的基因組進行測序的工作，研究結(jié)果分別發(fā)表在了好幾篇論文當(dāng)中，引起了廣泛的關(guān)注，并促進了古生物學(xué)基因組的研究。 隨后有人對長毛象（woolly mammoth）和更新世狼（Pleistocene wolves）的基因組開展了測序研究。

1.1.4.4 環(huán)境基因組學(xué)和感染性疾病研究領(lǐng)域

美國在2001年爆發(fā)了炭疽恐怖襲擊危機之后，454公司便對如何使用454測序儀對復(fù)雜的、未知的、未人工培養(yǎng)的環(huán)境微生物基因組進行測序展開了研究。前后兩個合作研究項目均表明454測序儀能夠用于從DNA混合樣品中發(fā)現(xiàn)未知微生物并對其進行分類。在第一個研究項目中，有三名患者都接受了同一名 澳大利亞器官捐贈者的器官，之后均因不明原因而死亡。從這三名死者身上提取了非人類DNA樣品進行測序，結(jié)果獲得了144,000條序列。分析后發(fā)現(xiàn)，這些序列分別屬于一種沙粒病毒科（Arenaviridae）家族病毒的14個不同基因。隨后進行的第二項研究在對健康蜂群和患病蜂群進行環(huán)境基因組學(xué)比較研究之后發(fā)現(xiàn)，以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus）是導(dǎo)致蜜蜂蜂群崩潰癥的元兇。上述這些研究都突出了454測序儀的一個特點，即在樣品準(zhǔn)備前不需要進行克隆或預(yù)擴增步驟，因此非常適用于對未知的未能人工培養(yǎng)的物種進行測序。這些特點也在其它對地下礦藏、深海、土壤和高鹽等環(huán)境下進行的環(huán)境微生物構(gòu)成方面的研究所證實。

1.1.4.5 基因組結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域

454測序儀技術(shù)的進步使它能夠適用于更多的科研領(lǐng)域。最新開發(fā)的末端配對測序法（paired-end sequencing）就非常適合用于發(fā)現(xiàn)人類基因組當(dāng)中的結(jié)構(gòu)變異。末端配對作圖過程（paired-end mapping），簡單來說就是對一個非洲人和一個歐洲人的基因組進行測序后發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異并對其作圖，最終將1,000多個3Kb或更長的結(jié)構(gòu)變異片段定 位到人類基因組參考序列中。研究發(fā)現(xiàn)，在人類基因組當(dāng)中存在的結(jié)構(gòu)變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了人們的預(yù)計，其中有很多變異都會造成非常重要的表型改變。這項對諾貝爾獎得主James Watson基因組進行測序的項目和其它相關(guān)研究，一起使得“人類基因多樣性（human genetic variation）”這一科學(xué)命題成為了《科學(xué)》（Science）雜志的年度重大科技突破。

1.2 Illumina測序儀

Illumina測序儀通常也被稱作Solexa測序儀（Illumina測序儀的特點見表5）。它適用于采用各種方法制備的DNA文庫，文庫中DNA片段可以長達數(shù)百bp，并可通過橋式PCR來擴增模板片段（圖5b）。在橋式PCR反應(yīng)中，正向引物和反向引物都被通過一個柔性接頭（flexible linker）固定在固相載體（solid substrate）上。經(jīng)過PCR反應(yīng)，所有的模板擴增產(chǎn)物就都被固定到了芯片上固定的位置。

值得注意的是，Illumina測序儀使用的橋式PCR與傳統(tǒng)的橋式PCR有所不同，它會交替使用Bst聚合酶進行延伸反應(yīng)以及使用甲酰胺 （formamide）進行變性反應(yīng)。這樣，經(jīng)過橋式PCR擴增之后，也會在固相載體上形成一個個的模板“克隆”。一塊芯片的8條獨立“泳道”上每一條泳道都可以容納數(shù)百萬的模板“克隆”，這樣一次就可以同時對8個不同的文庫進行測序。

經(jīng)過上述PCR擴增步驟之后，所有的模板都被線性化處理（linearization）而形成單鏈模板，接著與測序引物退火、雜交。隨后使用修飾的 DNA聚合酶和四種核苷酸混合試劑進行單堿基延伸測序反應(yīng)（圖6b）。這些核苷酸試劑都經(jīng)過兩種方式處理過，它們都是可逆的終止子（reversible terminator）。這些核苷酸的3’羥基端都有一個可被化學(xué)法切除的基團，這樣每一次反應(yīng)都只會摻入一個核苷酸，同時每種核苷酸都標(biāo)記上了可被化學(xué) 法切除的不同顏色的熒光基團，以標(biāo)識每種堿基。經(jīng)過一輪單堿基摻入反應(yīng)采集到信號之后，就可以通過化學(xué)方法切除上述被摻入核苷酸上標(biāo)記的兩個基團，然后就 能夠繼續(xù)摻入下一個核苷酸，重復(fù)測序反應(yīng)了。這種測序方法對36bp長度的序列測序準(zhǔn)確率是非常高的，不過如果處理更長的序列，準(zhǔn)確率就會有所降低了。