甲基化檢測

介紹

     DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的調(diào)控。CpG位點(diǎn)在基因組是不常見的，主要密集于接近基因啟動子的位置，統(tǒng)稱為CpG島CpG島大約含有500多個堿基，位于基因的啟動子區(qū)或第一個外顯子區(qū)。脊椎動物DNA的甲基化狀態(tài)與生長發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的下降。

甲基化特異性PCR（MSP）

      Herman 等（ 1996 ）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。 

 特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。

流程

﹡ 樣品用Qiagen試劑盒進(jìn)行基因組 DNA 提取與重亞硫酸鹽處理（包括純化和脫磺基反應(yīng)）。

﹡ 用甲基化引物設(shè)計(jì)相關(guān)軟件在甲基化區(qū)域設(shè)計(jì) 甲基化特異性的引物（ primer Ⅰ ）或非甲基化的引物（ primer Ⅱ ） 引物 2 對。

﹡ 進(jìn)行特異性的 PCR 擴(kuò)增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物。

﹡ 檢測 MSP 擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化 DNA 鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說明該被檢測的位點(diǎn)存在甲基化；若用針對處理后的非甲基化 DNA 鏈的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化。

亞硫酸氫鹽測序法（BSP）

亞硫酸氫鹽修飾后測序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA 甲基化方法，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。

 特點(diǎn)：精確度高，能夠準(zhǔn)確檢測出甲基化的程度百分比。

流程

﹡ 樣品用Qiagen試劑盒進(jìn)行基因組 DNA 提取與亞硫酸鹽處理（包括純化和脫磺基反應(yīng)），使 DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。

﹡ 用甲基化引物設(shè)計(jì)相關(guān)軟件在甲基化區(qū)域兩端設(shè)計(jì)引物。

﹡ 進(jìn)行基因擴(kuò)增及 PCR 產(chǎn)物回收。

﹡ PCR 產(chǎn)物直接測序或克隆測序（定量分析），分析每個 CpG 島甲基化情況 。

﹡ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。與未甲基化的 DNA 樣本進(jìn)行比對。

樣本要求

■ DNA樣品：濃度≥100ng/ul、體積≥20ul的總DNA樣品，DNA抽提：血液20元/樣本；新鮮組織30元/樣本；石蠟包埋組織50元/樣本

■ 血液樣品：請?zhí)峁?ge;500ul抗凝血；采用標(biāo)準(zhǔn)的采樣管， EDTA 抗凝或枸椽酸鈉抗凝

■ 組織樣品：請?zhí)峁┳懔康慕M織樣品（≥300mg）

■ 細(xì)胞（≥10⁶ ）

■ 甲基化位點(diǎn)信息：免費(fèi)提供甲基化島分析

提供結(jié)果

MSP：引物序列、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、包括MSP產(chǎn)物的電泳圖片

BSP：引物序列、測序峰圖、陽性克隆質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)報(bào)告