光片—共聚焦多尺度3D成像在腫瘤微循環(huán)研究的應(yīng)用
腫瘤微環(huán)境（TME）的異質(zhì)性和復(fù)雜性對(duì)癌癥研究提出了巨大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)二維成像技術(shù)難以全面捕捉腫瘤在宏觀組織、介觀區(qū)域和細(xì)胞層面的動(dòng)態(tài)特征，而單一的三維光學(xué)成像方法往往受限于分辨率或視野范圍，無(wú)法兼顧多尺度分析需求。近年來(lái)，光片顯微鏡（LSFM）和共聚焦顯微鏡（CLSM）分別憑借大視野成像和高分辨率優(yōu)勢(shì)，成為腫瘤研究的重要工具。然而，如何在同一組織樣本中實(shí)現(xiàn)兩種技術(shù)的無(wú)縫銜接，并精準(zhǔn)追蹤特定區(qū)域（ROI）的跨尺度關(guān)聯(lián)，始終是技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。
研究通過創(chuàng)新性地結(jié)合光激活染料標(biāo)記與透明化試劑切換技術(shù)，開發(fā)了一套從全器官到細(xì)胞級(jí)的多尺度三維成像流程。該技術(shù)不僅解決了傳統(tǒng)物理切片導(dǎo)致的ROI定位偏差問題，還首次實(shí)現(xiàn)了腫瘤免疫微環(huán)境的高精度空間定量分析，為評(píng)估癌癥治療響應(yīng)和探索轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了全新視角。
研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
腫瘤多尺度成像的迫切需求
腫瘤是由癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等異質(zhì)性成分構(gòu)成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，其空間分布特征直接影響疾病進(jìn)展和治療效果。例如，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)深度、血管異常結(jié)構(gòu)、壞死區(qū)域分布等宏觀特征，與特定亞區(qū)的細(xì)胞間相互作用共同決定了腫瘤的生物學(xué)行為。因此，開發(fā)能夠同時(shí)解析毫米級(jí)組織結(jié)構(gòu)和微米級(jí)細(xì)胞排列的多尺度成像技術(shù)，已成為癌癥研究的重要方向。
光片顯微鏡（LSFM）通過有機(jī)溶劑透明化處理，可對(duì)小鼠全腦或整塊腫瘤進(jìn)行快速三維掃描，但其分辨率（通常為微米級(jí)）難以揭示細(xì)胞間相互作用細(xì)節(jié)。共聚焦顯微鏡（CLSM）雖能實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞級(jí)成像，卻受限于數(shù)百微米的組織穿透深度。過去嘗試通過物理切片銜接兩種技術(shù)時(shí)，因組織回縮變形和ROI定位丟失，導(dǎo)致跨尺度數(shù)據(jù)難以精準(zhǔn)關(guān)聯(lián)，嚴(yán)重制約了三維空間分析的可靠性。
技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
光激活染料介導(dǎo)的ROI追蹤技術(shù)
研究的核心創(chuàng)新在于開發(fā)了一種基于紫外光激活（UVA）染料的標(biāo)記技術(shù)。這種染料在紫外光照射下會(huì)發(fā)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，從透明狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙瑥亩诮M織周圍的瓊脂糖凝膠上留下清晰的標(biāo)記線。這種標(biāo)記方法不僅能夠在光片顯微鏡下實(shí)現(xiàn)光學(xué)標(biāo)記，還能通過物理切割瓊脂糖凝膠保留標(biāo)記位置，確保在后續(xù)的共聚焦顯微鏡成像中準(zhǔn)確找到感興趣區(qū)域。
研究突破性地實(shí)現(xiàn)了有機(jī)溶劑體系與水溶性糖溶液的逆向轉(zhuǎn)換。通過梯度乙醇再水化處理，組織從高折射率（RI≈1.56）的疏水性透明狀態(tài)恢復(fù)至親水性，為后續(xù)免疫熒光標(biāo)記和共聚焦成像創(chuàng)造了條件。這種可逆的透明化策略，使得同一組織樣本能先后經(jīng)歷LSFM宏觀掃描和CLSM高分辨成像，且關(guān)鍵區(qū)域的空間信息得以完整保留。
成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
跨尺度成像的精準(zhǔn)性驗(yàn)證
為驗(yàn)證ROI追蹤精度，研究團(tuán)隊(duì)將熒光微球（直徑50-200μm）嵌入瓊脂糖模擬腫瘤組織。LSFM定位微球后，通過光激活標(biāo)記和振動(dòng)切片成功獲取含目標(biāo)微球的400μm厚切片，CLSM成像顯示空間坐標(biāo)偏差小于5μm。進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）和特征點(diǎn)匹配算法（SIFT-FLANN）分析發(fā)現(xiàn)，LSFM與CLSM的虛擬切面圖像相似度達(dá)0.68-0.89（滿分1.0），輪廓匹配誤差低于3%，證實(shí)了跨尺度數(shù)據(jù)的空間一致性。
在干擾素基因刺激因子激動(dòng)劑處理的乳腺腫瘤模型中，LSFM宏觀成像顯示治療組出現(xiàn)高強(qiáng)度自發(fā)熒光區(qū)域。通過關(guān)聯(lián)CLSM三維成像發(fā)現(xiàn)，這些區(qū)域?qū)?yīng)CD45+免疫細(xì)胞浸潤(rùn)率提升至75%（對(duì)照組僅9%），而CK8+癌細(xì)胞密度下降至10%（對(duì)照組78%）。細(xì)胞級(jí)分析進(jìn)一步揭示，治療組中80%的癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞發(fā)生直接接觸（對(duì)照組35%），且免疫細(xì)胞從基質(zhì)向腫瘤實(shí)質(zhì)的穿透距離增加近3倍（14μmvs.5μm），從空間維度揭示了藥物誘導(dǎo)的免疫激活機(jī)制。
腦轉(zhuǎn)移病灶的原位定位
在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型中，LSFM全腦掃描檢測(cè)到左側(cè)皮層結(jié)構(gòu)異常。通過ROI追蹤獲取的腦組織切片中，CLSM成功識(shí)別出直徑約200μm的CK8+轉(zhuǎn)移灶，并發(fā)現(xiàn)周圍聚集大量CD45+免疫細(xì)胞。這種從全腦異常篩查到轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞級(jí)表征的無(wú)縫銜接，為研究腫瘤轉(zhuǎn)移早期的免疫應(yīng)答提供了重要工具。
整個(gè)腫瘤宏觀切片的高分辨率3D多路復(fù)用圖像
總結(jié)與展望
研究建立的關(guān)聯(lián)多尺度三維成像技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了從整塊腫瘤組織到特定細(xì)胞群的跨層級(jí)空間解析。通過光激活標(biāo)記與可逆透明化技術(shù)的創(chuàng)新結(jié)合，解決了多模態(tài)成像中的ROI追蹤難題，為腫瘤異質(zhì)性分析、治療響應(yīng)評(píng)估和轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了標(biāo)準(zhǔn)化方案。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，該技術(shù)對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、基質(zhì)-腫瘤界面相互作用等關(guān)鍵生物學(xué)過程具備亞細(xì)胞級(jí)的定量解析能力，其精度顯著優(yōu)于傳統(tǒng)分段成像方法。隨著空間組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，本方法與轉(zhuǎn)錄組、蛋白組數(shù)據(jù)的多維整合，有望繪制更全面的腫瘤微環(huán)境圖譜，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)向三維空間維度縱深發(fā)展。
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Zheng J, Wu YC, Cai X, Phan P, Gill M, Er EE, Zhao Z, Wang ZJ, Lee SS. Correlative multiscale 3D imaging of mouse primary and metastatic tumors by sequential light sheet and confocal fluorescence microscopy. iScience. 2025 Feb 3;28(3):111934.
DOI:10.1016/j.isci.2025.111934.
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