一篇講透：干細胞轉染及基因編輯

目前有多種方法可以將基因導入真核細胞內，一般可分為病毒類載體技術和非病毒類載體技術，后者具有低毒性和低免疫反應的特點，且不受細胞或種屬特異機制和導入片段大小等限制的優(yōu)勢。其中，電穿孔法以其較高的轉染率而備受關注。電穿孔法是應用短暫的高壓電流脈沖誘導活細胞產生跨膜電位，由于外加電場強度大于細胞膜穿孔的臨界值，引起細胞質膜結構暫時性改變，形成納米級微孔，DNA等外源物質通過這些微孔進入細胞質或細胞核。

大多數細胞通過傳統(tǒng)轉染技術就可以提高轉染效率，而原代細胞、免疫細胞、神經細胞、干細胞等難以通過傳統(tǒng)方法獲得高轉染效率，成為困擾科研人員的難題。NEPA GENE公司在細胞轉染和融合領域擁有超過二十年的研究經驗，其代表產品NEPA21高效基因轉染系統(tǒng)自上市以來受到了國內外眾多科學家的青睞。在干細胞轉染方面，如iPS、ESC、HSC和MSC等細胞，NEPA21均被研究者們用于轉染實驗中，積累了豐富的轉染條件、細胞轉染效率和基因編輯效率等寶貴的經驗和數據。

 

案例一 使用NEPA21電轉染儀將mRNA導入hESC

參考文獻：Gene Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by In Vitro-Synthesized mRNA for Gene Therapy

轉染物質：GFP / DsRed mRNA

電轉參數：電壓125V（文中只寫明電壓，詳細參數可來電咨詢）

在本研究中，作者通過體外轉錄合成多種類型的mRNA，使用NEPA21電轉儀將其導入到hESC中，以研究mRNA在hESC中的轉染效率和誘導蛋白表達的時間（圖1）。同時，為了保證轉染效率對HN4細胞系不具有特異性，作者對多種hESC細胞系和iPS的轉染效率進行了比較。在電穿孔24h后，F(xiàn)CAS分析顯示，GFP mRNA在HN4、NS1、NS2和iPS中表達量均在95%以上（圖1）。

圖1 電穿孔24h后，GFP在不同細胞系中的轉染效率
 

在電穿孔后，是否能維持胚胎干細胞的多能性仍需要進一步的檢測。在此，研究人員通過免疫熒光法檢測了兩種常見的標志基因（Oct4和SSEA4）。結果顯示，轉染24h后，大多數表達GFP的細胞仍然呈Oct4陽性和SSEA4陽性。
 

圖2 電穿孔24h后，HN4細胞中Oct4和SSEA4基因的表達
 

此外，研究人員還證明采用電穿孔法可以有效地將GFP和DsRed mRNA共轉染至HN4細胞中（圖3）。
 

圖2 GFP和DsRed mRNA共轉染
 

案例二  使用NEPA21進行iPSC電轉及基因編輯（CRSIPR/TALENs）

參考文獻：

1.Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9.

2. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system

轉染物質：EGFP質粒、敲除實驗（TALENs: 5μg left + 5μg right或CRISPR: 5μg Cas9 + 5μg sgRNA）、敲入實驗（5μg donor vector + TALENs（5μg left + 5μg right）或CRISPR（5μg Cas9 + 5μg sgRNA））

電轉參數：電壓125V、脈沖時長5ms、脈沖次數2

為了在iPS細胞中獲得最高的質粒轉染效率，研究人員使用EGFP質粒轉染了3種iPS細胞系（201B7、404C2、DMD-iPSC），優(yōu)化脈沖電壓、脈沖時間等轉染條件。結果如下圖所示：

圖4 iPSC轉染條件優(yōu)化
 

使用NEPA21優(yōu)化轉染條件之后，通過TALEN和CRISPR兩種方法對iPSC的DMD基因進行敲除和敲入實驗，基因編輯效率如下：

Knockout：
 

圖5 iPSC基因敲除效率
 

Knockin：
 

圖6 iPSC基因敲入效率

 

案例三  使用NEPA21進行HSC轉染條件優(yōu)化及基因編輯（CRISPR）

參考文獻：Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9

轉染質粒：CRISPR/RNP

電轉參數：穿孔參數（電壓100V、脈沖時長5ms、脈沖次數8）、轉移參數（電壓10V、脈沖時長50ms、脈沖次數5），本文使用1mm間隔電轉杯

在這項研究中，研究者旨在通過連續(xù)移植來評估真正的HSCs的基因組編輯效率。為了避免病毒整合到HSC基因組中，采用了非病毒轉染方法（電穿孔）來編輯小鼠HSC的基因組。首先通過電穿孔將Cas9/RNP轉移到體外的HSC中，隨后通過三次細胞移植來檢驗真正的HSC的敲除效率。此外，通過基因插入，還成功地證明了對小鼠HSCs中X-SCID突變的基因校正，從而治愈了小鼠。

研究人員首先以GFP為報告基因，通過NEPA21在小鼠骨髓系陰性細胞（Lin^-）中優(yōu)化了電穿孔條件，并通過GFP熒光和7-氨基-放線菌素D（7-AAD）染色檢測細胞轉染效率和細胞存活率。結果顯示，在電壓100V、脈沖時間5ms、脈沖次數8次的電轉條件下，細胞轉染效率>60%，存活率>50%，可作為后續(xù)實驗的電穿孔參數（圖7）。

圖7 HSC轉染效率
 

隨后，將針對Itga2b基因外顯子1和2的RNP復合體電穿孔轉染至Lin^-細胞。在體外培養(yǎng)1~2周后，通過Surveyor實驗檢測到Itga2b外顯子1和2的突變，并且將基因編輯后的Lin^-細胞通過連續(xù)移植后仍能檢測到15%定點突變效率，證明了基因編輯發(fā)生在真正的HSC中（圖8）。

圖8 在HSC中敲除Itga2b結果
 

為了恢復X-SCID小鼠的IL2RG基因功能，研究者采取了基于NHEJ和同源無關的靶向整合（HITI）的策略，將IL2RG外顯子2-8（HITI-cDNAex2-8）整合到IL2RG的內含子1。他們先在NIH3T3細胞中測試了該方法，通過NEPA21電轉儀導入IL2RG內含子1的gRNA與Cas9（Cas9/RNP-Il2rgin1），在NIH 3T3細胞中有效地產生了43.1%的突變。基于此，進一步檢測了在Lin^-細胞中的基因插入效率，通過Surveyor分析和擴增序列測定，細胞基因突變效率為20.2%（圖9）。
 

圖9 在HSC中對IL2RG基因插入結果
 

本文中提到，Cas9/RNP通過電穿孔到造血干細胞，可以不使用任何病毒載體，基因編輯技術為基因位點的特異性修飾提供了可能。非整合病毒如腺病毒或腺相關病毒（AAV）經常被用來傳遞CRISPR/Cas9，但它們會在宿主中激發(fā)對組成性表達的Cas9的免疫反應。相反，Cas9/RNP在轉導細胞中迅速降解，從而逃避宿主的免疫反應，更重要的是，電穿孔與其他傳遞方法相比，產生的脫靶DSB更少。

 

案例四  使用NEPA21電轉MSC的最佳條件

參考文獻：電穿孔法轉染臍帶華通膠間充質干細胞的最佳條件

轉染物質：EEV-EGFP質粒

電轉參數：電壓150V、脈沖時長5ms、脈沖間隔50ms、脈沖次數2

本文采用電穿孔法將質粒EEV-EGFP轉入華通膠間充質干細胞（WJ-MSC），并通過流式細胞儀檢測轉染率，以探討不同電穿孔條件對WJ-MSC轉染效率的影響，確定最佳電轉染條件。

研究人員測試了不同電壓（125，130，140，150，170V）、不同脈沖時間（2.5，5.0，7.5ms）、不同細胞狀態(tài)（體積分數為20%正常氧、體積分數為5%低氧）對WJ-MSC電轉染效率的影響。電穿孔后48h進行檢測，轉染質粒攜帶EGFP綠色熒光標簽，轉染成功的WJ-MSC將表達綠色熒光蛋白，使用流式細胞儀檢測熒光表達率。

結果表明，正常培養(yǎng)的WJ-MSC在電壓150V、脈沖時長5.0ms、脈沖間隔時間50ms、脈沖數2次時可達到較高的電轉染率。
 

圖10 不同轉染條件下WJ-MSC的轉染效率
 

總結

眾所周知，較高的電穿孔條件可以更有效地編輯基因組，但會對細胞造成較大損傷，而較弱的電轉染條件對細胞更溫和，但細胞轉染效率和編輯效率可能較低。因此，為基因組編輯效率和細胞活力找到一個可接受的條件是十分重要的。NEPA21采用獨特的四步法電轉程序，可對細胞穿孔模式和基因轉移模式中的所有參數進行單獨設置（電壓、脈沖時長、脈沖間隔、脈沖次數和衰減比例），非常有利于難轉染細胞的參數優(yōu)化，提高轉染效率。

NEPA21高效基因轉染系統(tǒng)采用全新設計的電轉程序，配合專利的電壓衰減設計，在獲得高轉染效率的同時，提高細胞存活率。操作簡單，電轉參數可見可調，適用性強。特別適用于難轉染的原代免疫細胞、干細胞、神經細胞、外泌體、類器官、活體動物、受精卵及宮內胚胎等的轉染，已應用于眾多著名期刊文獻中，是進行細胞懸浮/貼壁狀態(tài)、活體和離體組織轉染的電轉系統(tǒng)主流品牌之一。

本文引用的案例均為已發(fā)表文獻，想了解NEPA21更多應用案例或實驗細節(jié)可來電咨詢。

 

參考文獻及鏈接：

1.Li Wang X, Yu L, Ding Y, et al. Gene manipulation of human embryonic stem cells by in vitro-synthesized mRNA for gene therapy[J]. Current Gene Therapy, 2015, 15(4): 428-435.（https://www.researchgate.net/publication/276922586_Gene_Manipulation_of_Human_Embryonic_Stem_Cells_by_In_Vitro-Synthesized_mRNA_for_Gene_Therapy）

2.Li H L, Fujimoto N, Sasakawa N, et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9[J]. Stem cell reports, 2015, 4(1): 143-154.（https://www.cell.com/stem-cell-reports/pdf/S2213-6711(14)00335-X.pdf）

3.Li H L, Gee P, Ishida K, et al. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system[J]. Methods, 2016, 101: 27-35.（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104620231530133X）

4.Byambaa S, Uosaki H, Ohmori T, et al. Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9[J]. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2021, 20: 451-462.（https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(21)00001-2?elqTrackId=1f53a0d0cd5f4ebd83035146680a5eb2）

5.王澤, 李春花, 張寧坤, 等. 電穿孔法轉染臍帶華通膠間充質干細胞的最佳條件[J]. 中國組織工程研究, 2018, 22(17): 2717.（https://www.cjter.com/CN/10.3969/j.issn.2095-4344.0870）

 

END

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