放血對(duì)低壓缺氧所致幼鼠骨退化的治療作用

文獻(xiàn)信息
西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院生物樣本庫(kù)、青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心等的研究成果《Therapeutic effect of bloodletting on bone deterioration induced by hypobaric hypoxia in young rats》（放血對(duì)低壓缺氧所致幼鼠骨退化的治療作用）在期刊《Bone》上發(fā)表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供了重要的大鼠股骨圖像和定量分析結(jié)果。

該論文的通訊作者為湯峰，鄔云紅，第一作者為郝豆豆。

文獻(xiàn)摘要
目的：高海拔地區(qū)，包括缺氧條件，與不同的海拔引起的病理有關(guān)，包括骨密度降低。闡明這種環(huán)境下骨退化的機(jī)制和開發(fā)有針對(duì)性的干預(yù)和治療方法是很重要的。放血療法具有良好的臨床應(yīng)用前景，但其對(duì)骨骼系統(tǒng)和骨穩(wěn)態(tài)的影響尚不清楚。本研究旨在探討低壓缺氧環(huán)境對(duì)幼年SD大鼠特定股骨形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性的影響，包括骨體積、皮質(zhì)厚度和小梁微結(jié)構(gòu)，并探討放血干預(yù)對(duì)這些參數(shù)的潛在調(diào)節(jié)作用。

方法：6周齡雄性SD大鼠，模擬5000-m海拔的低氣壓缺氧環(huán)境，持續(xù)12周。放血干預(yù)組大鼠每周尾靜脈抽血500 μL。采用Micro-CT技術(shù)、蘇木精和伊紅染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色綜合評(píng)價(jià)股骨微結(jié)構(gòu)、組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。此外，通過(guò)免疫熒光分析來(lái)量化關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)鑒定差異表達(dá)基因。
結(jié)果：暴露在低氧環(huán)境下的大鼠骨礦物質(zhì)含量、骨小梁數(shù)量和骨皮質(zhì)厚度明顯減少，表明骨微結(jié)構(gòu)惡化。此外，缺氧環(huán)境上調(diào)RANKL和HIF-1α的表達(dá)，下調(diào)RUNX2的表達(dá)。值得注意的是，盡管放血干預(yù)并沒(méi)有顯著逆轉(zhuǎn)這些骨結(jié)構(gòu)變化，但轉(zhuǎn)錄組分析揭示了放血干預(yù)對(duì)關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，尤其是Mmp2、Fosl2和URS0000B2A65A，這些基因與缺氧反應(yīng)、破骨細(xì)胞分化和PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)。
  結(jié)論：本研究強(qiáng)調(diào)了低壓缺氧對(duì)幼年大鼠骨骼微觀結(jié)構(gòu)的不利影響，并強(qiáng)調(diào)了放血改善這種情況的治療潛力。此外，對(duì)放血對(duì)基因表達(dá)影響的調(diào)控機(jī)制的研究為骨改變提供了新的視角。它為開發(fā)新的預(yù)防措施和靶向治療方法提供了有希望的途徑，以解決相關(guān)骨疾病帶來(lái)的挑戰(zhàn)。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物準(zhǔn)備
選用雄性無(wú)特定病原體級(jí)SD大鼠30只，4-6周齡。在1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)期后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC）、低壓缺氧組（HH）和低壓缺氧放血組（HH- BL），每組10只。對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)在青海大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施（海拔2261 m）， HH組和HH- BL組大鼠飼養(yǎng)在模擬海拔5000 m（大氣壓力54 kPa）的9000 × 3200 × 3200 mm的低壓缺氧艙中所有大鼠維持12小時(shí)的光照/黑暗周期，并給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（由中國(guó)北京高協(xié)和飼料有限公司提供）和隨意飲水。動(dòng)物室溫和濕度分別保持在20±2◦C和60±5%。HH組和HH- bl組大鼠連續(xù)置于低壓缺氧艙12周，每周更換籠褥和設(shè)備。在換料和換料期間，海拔高度調(diào)整為3500 m（大氣壓64.9 kPa），其余時(shí)間保持5000 m的模擬海拔高度。HH-BL組大鼠每周尾靜脈抽血500 μL，連續(xù)12周。

Micro CT掃描
安樂(lè)死后，取大鼠左股骨標(biāo)本，快速浸泡在含有0.1 M磷酸鈉（pH 7.0）的4%多聚甲醛固定液中，以確保保存標(biāo)本的原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。為了進(jìn)一步探索股骨的微結(jié)構(gòu)，作者采用了高分辨率Micro CT技術(shù)（NEMO，NMC-100,平生醫(yī)療科技有限公司）。在掃描過(guò)程中，樣品被放置在X射線源和高性能CMOS探測(cè)器之間。樣本在掃描區(qū)域內(nèi)沿其垂直長(zhǎng)軸進(jìn)行了360度旋轉(zhuǎn)，總共進(jìn)行了4000次精確的投影。具體掃描參數(shù)設(shè)置為：電壓90 kV，電流0.06 mA。掃描完成后，作者利用Avatar v1.6.9.3軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入的三維重建和綜合分析。作者選擇感興趣區(qū)域（ROI）來(lái)評(píng)估股骨的微觀特征，如下所示：首先，關(guān)注位于距股骨干骺端生長(zhǎng)板1.5 mm處的2 mm高的骨小梁區(qū)域；其次，對(duì)距離生長(zhǎng)板10 mm的2 mm長(zhǎng)的皮質(zhì)骨段進(jìn)行分析，得到皮質(zhì)骨厚度、骨礦物質(zhì)含量、骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁間距等關(guān)鍵指標(biāo)數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
為了評(píng)估慢性低氧對(duì)大鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響和放血治療的潛在作用，作者對(duì)大鼠股骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的分析�；�于Micro CT，在ROI中檢查股骨干骺端和皮質(zhì)骨（圖2A -  B），三維圖像顯示冠狀面、矢狀面和軸向面（圖2C - F）。Micro CT分析顯示，低氣壓缺氧組皮質(zhì)骨量顯著減少，表現(xiàn)為皮質(zhì)厚度、骨礦物質(zhì)含量和皮質(zhì)骨體積減少。然而，放血治療并沒(méi)有顯著改善低氣壓缺氧大鼠的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)（圖2g - 1）。脛骨生物力學(xué)測(cè)試顯示，在12周的低氣壓缺氧后，最大骨折力下降，表明骨力學(xué)性能降低，而放血治療傾向于改善這一點(diǎn)（圖2J）。在股骨小梁骨中，低氣壓缺氧組表現(xiàn)出明顯的骨丟失，骨小梁分離增加，骨礦物質(zhì)含量、骨小梁體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)量減少，但骨小梁厚度無(wú)明顯變化。雖然放血治療導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)有所改善，但骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3e - 1）。這些發(fā)現(xiàn)為慢性低壓缺氧對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響和放血的潛在治療效果提供了有價(jià)值的見解。

圖2所示。低氧缺氧對(duì)年輕雄性SD大鼠皮質(zhì)骨退化的影響及放血治療的潛在緩解作用。(A-B) 分析骨骼微觀結(jié)構(gòu)的興趣體積（VOI）選擇的描述，其中粉紅色表示小梁骨，藍(lán)色表示皮質(zhì)骨。（C-F）在冠狀面、矢狀面和軸向面顯示股骨干骺端骨微觀結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的代表性三維圖像。（G-I）皮質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量分析，包括皮質(zhì)厚度（Ct.Th）、皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Ct.BMC）、皮質(zhì)骨體積（Ct.BV）。(J)生物力學(xué)分析揭示脛骨骨折的極限破壞載荷（UFL）。實(shí)驗(yàn)采用正常對(duì)照組（NC）和低氧放血組（HH- bl）各10只大鼠和低氧放血組（HH）各9只大鼠。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Bonferroni校正的單因素方差分析評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。* p < 0.01；** p < 0.0001。

使用結(jié)論
綜上所述，放血治療對(duì)大鼠無(wú)不良影響，且未對(duì)本研究測(cè)量的任何骨參數(shù)產(chǎn)生明顯改變。然而，在骨髓細(xì)胞和干骺端骨組織的表達(dá)模式中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證，受低壓缺氧和放血治療的調(diào)節(jié)，尚未在體外進(jìn)行，這是研究的關(guān)鍵下一步。然而，這一研究結(jié)果有望為預(yù)防和治療因低氣壓缺氧所引發(fā)的骨疾病的提供新策略。

使用設(shè)備

  Micro CT (型號(hào)：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）