大組織成像技術(shù)新突破：信號(hào)改進(jìn)型超快光片顯微鏡（SIFT）

在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，對(duì)大組織進(jìn)行高分辨率、快速且精確的成像一直是科學(xué)家們追求的目標(biāo)。傳統(tǒng)的成像技術(shù)在面對(duì)這一挑戰(zhàn)時(shí)，往往存在諸多局限性。共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡雖然在細(xì)胞成像方面表現(xiàn)出色，但在處理大組織成像時(shí)，速度慢、光劑量高、穿透深度淺以及分辨率各向異性等問(wèn)題逐漸凸顯。這些問(wèn)題使得它們難以滿足對(duì)大組織進(jìn)行全面、細(xì)致成像的需求。

近年來(lái)，光片顯微鏡（LSM）與組織透明化技術(shù)的結(jié)合為大組織成像帶來(lái)了新的希望。組織透明化技術(shù)通過(guò)改善組織內(nèi)部折射率（RI）的不匹配，減少了光的散射，使得光能夠更深入地穿透組織。這一技術(shù)突破使得更多實(shí)驗(yàn)室能夠?qū)⒖焖偃�維成像和組織學(xué)研究應(yīng)用于各種生物樣本，從小鼠、大鼠、兔子到果蠅，甚至人類組織。然而，即使在LSM技術(shù)不斷發(fā)展的今天，高分辨率成像大組織仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。

在這樣的背景下，一種名為信號(hào)改進(jìn)型超快光片顯微鏡（SIFT）的新型成像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，展示了成像平臺(tái)在各種透明化組織樣本上的性能，并描述了其在各種透明化方案中的穩(wěn)健性，為大組織成像研究提供了新的解決方案。

研究?jī)?nèi)容：SIFT技術(shù)的創(chuàng)新設(shè)計(jì)與原理
1、SIFT的光學(xué)設(shè)計(jì)
雙光片同步掃描：SIFT將傳統(tǒng)遠(yuǎn)程聚焦設(shè)置分為兩個(gè)相同的遠(yuǎn)程聚焦臂，通過(guò)精確透鏡對(duì)組合實(shí)現(xiàn)瞳孔匹配，保持光路長(zhǎng)度相同，利用透鏡的線性運(yùn)動(dòng)范圍實(shí)現(xiàn)焦點(diǎn)的亞像素級(jí)運(yùn)動(dòng)，兩個(gè)焦點(diǎn)對(duì)稱放置且間距固定，由線性聚焦actuator（LFA）同步移動(dòng)，通過(guò)檢測(cè)物鏡成像在相機(jī)上，實(shí)現(xiàn)了在整個(gè)視野（FOV）內(nèi)的均勻分辨率和高質(zhì)量同步。

提高成像速度和信號(hào)強(qiáng)度：SIFT在特定幀率下，通過(guò)雙光片掃描，每個(gè)光片覆蓋FOV的一半，使有效曝光時(shí)間翻倍，從而提高信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于熒光信號(hào)強(qiáng)的樣本，可在相同檢測(cè)光子預(yù)算和照明功率下，將幀率提高四倍，且在多種組織成像中表現(xiàn)出色，如小鼠前爪和胃的成像實(shí)驗(yàn)中，成像速度顯著提升。

2、深度學(xué)習(xí)輔助組織邊界評(píng)估
為了進(jìn)一步提高成像效率，SIFT引入了深度學(xué)習(xí)（DL）技術(shù)。研究人員精心設(shè)計(jì)了DL分類算法，這一算法就像一位智能的助手，能夠幫助SIFT智能地執(zhí)行中尺度結(jié)構(gòu)評(píng)估任務(wù)。可以準(zhǔn)確地區(qū)分有信息和無(wú)信息的圖像塊，就像在一堆雜亂無(wú)章的拼圖碎片中，迅速挑選出有用的部分。通過(guò)生成組織邊界坐標(biāo)圖，SIFT能夠精準(zhǔn)地定位到組織中真正需要高分辨率成像的區(qū)域，避免了對(duì)無(wú)信息區(qū)域的不必要成像，從而大大減少了高分辨率成像的體積。

在實(shí)際應(yīng)用中，這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)得淋漓盡致。例如，在對(duì)復(fù)雜形狀的組織進(jìn)行成像時(shí)，傳統(tǒng)方法可能需要對(duì)整個(gè)組織進(jìn)行高分辨率掃描，耗費(fèi)大量的時(shí)間和存儲(chǔ)空間。而SIFT結(jié)合DL算法，能夠快速篩選出包含組織信息的區(qū)域，只對(duì)這些關(guān)鍵區(qū)域進(jìn)行高分辨率成像，大大提高了成像效率。值得一提的是，這個(gè)分類器具有很強(qiáng)的通用性，它與標(biāo)本類型無(wú)關(guān)，無(wú)論面對(duì)何種生物樣本，都能發(fā)揮出色的分類作用。這意味著研究人員在研究不同類型的組織時(shí)，無(wú)需針對(duì)新樣本類型進(jìn)行繁瑣的訓(xùn)練，就像一把萬(wàn)能鑰匙，能夠輕松打開(kāi)各種組織成像的大門。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：多維度驗(yàn)證SIFT的卓越性能
1、顯微鏡性能量化
空間分辨率：為了準(zhǔn)確評(píng)估SIFT的空間分辨率性能，研究人員采用了一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法。他們將500nm的熒光珠嵌入2%的瓊脂糖中，制備成實(shí)驗(yàn)樣本。隨后，將瓊脂糖樣本安裝在定制的支架上，并使用線性壓電平臺(tái)精確地軸向移動(dòng)樣本。在成像過(guò)程中，SIFT展現(xiàn)出了令人矚目的性能，圖像的分辨率得到了進(jìn)一步提升。意味著SIFT能夠清晰地分辨出組織內(nèi)部微小結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)，為精準(zhǔn)的組織形態(tài)學(xué)研究提供了有力支持。與傳統(tǒng)的成像技術(shù)相比，SIFT在空間分辨率上的優(yōu)勢(shì)使其能夠更準(zhǔn)確地揭示組織內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布。

時(shí)間分辨率：時(shí)間分辨率是衡量顯微鏡成像速度的關(guān)鍵指標(biāo)。SIFT在這方面表現(xiàn)出色，其定義為在最大視野（FOV）下獲取一幀圖像所需的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SIFT能夠在25ms內(nèi)獲取一幀覆蓋整個(gè)FOV的圖像，而傳統(tǒng)的則需要100ms。這一顯著的速度提升得益于SIFT獨(dú)特的光學(xué)設(shè)計(jì)，使得兩個(gè)焦點(diǎn)能夠同步移動(dòng)，有效減少了成像過(guò)程中的延遲。通過(guò)對(duì)比可以清晰地看出，SIFT的幀獲取時(shí)間相比傳統(tǒng)ASLM提高了四倍。這一速度優(yōu)勢(shì)在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義，特別是在對(duì)動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行成像時(shí)，SIFT能夠更及時(shí)、準(zhǔn)確地捕捉到組織內(nèi)部的變化。

2、多組織成像驗(yàn)證
小鼠前爪和胃成像：研究人員運(yùn)用SIFT和傳統(tǒng)ASLM對(duì)小鼠前爪和胃進(jìn)行了成像實(shí)驗(yàn)，以對(duì)比兩種技術(shù)的性能。在對(duì)小鼠前爪的成像中，樣本經(jīng)過(guò)了組織透明化處理，標(biāo)記了外周神經(jīng)、相關(guān)細(xì)胞以及組織的自發(fā)熒光信號(hào)（用于顯示大體結(jié)構(gòu)，在綠色熒光發(fā)射通道成像）。SIFT在成像速度上展現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于雙色清除小鼠前爪，SIFT的總幀獲取時(shí)間僅為4.93小時(shí)，而傳統(tǒng)ASLM則需要長(zhǎng)達(dá)19.73小時(shí)。在對(duì)小鼠胃的成像實(shí)驗(yàn)中，同樣使用了SIFT和傳統(tǒng)ASLM進(jìn)行對(duì)比。SIFT在成像過(guò)程中，通過(guò)深度學(xué)習(xí)（DL）算法，從5054個(gè)低分辨率圖像塊中篩選出了2171個(gè)包含組織信息的圖像塊進(jìn)行高分辨率成像。SIFT的總幀獲取時(shí)間為6.40小時(shí)，而傳統(tǒng)ASLM則需要25.63小時(shí)。

多透明成像：SIFT的多透明物鏡是其另一大亮點(diǎn)，使其能夠?qū)�組織透明化處理并浸于不同折射率介質(zhì)中的樣本進(jìn)行成像。在對(duì)斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的成像實(shí)驗(yàn)中，研究人員選擇了3天受精后的斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)，將其麻醉后嵌入1.5%瓊脂糖中，并安裝在氟乙烯丙烯（FEP）管中（其折射率與水匹配）。SIFT能夠清晰地觀察到斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)在尾損傷后的炎癥反應(yīng)，以及穩(wěn)態(tài)條件下細(xì)胞在整個(gè)幼蟲(chóng)體內(nèi)的發(fā)育變化。在對(duì)小鼠結(jié)腸的成像中，經(jīng)過(guò)整體組織透明技術(shù)處理，并進(jìn)行免疫染色。SIFT的各向同性分辨率使得研究人員能夠清晰地觀察到結(jié)腸組織中神經(jīng)元的樹(shù)突和突起，以及神經(jīng)元之間的連接。在對(duì)小鼠腦的成像實(shí)驗(yàn)中，分別使用了整體組織透明小鼠腦。SIFT能夠?qū)Υ竽X進(jìn)行高分辨率成像，清晰地顯示出神經(jīng)元的活動(dòng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了有力的工具。

研究結(jié)論：SIFT推動(dòng)大組織成像技術(shù)邁向新高度
這一創(chuàng)新技術(shù)通過(guò)獨(dú)特的雙焦點(diǎn)成像方案和深度學(xué)習(xí)分類網(wǎng)絡(luò),顯著提升了大組織成像的速度和效率。在多種樣本成像實(shí)驗(yàn)中，SIFT均表現(xiàn)出卓越的性能，無(wú)論是小鼠前爪、胃，還是斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)、小鼠結(jié)腸和大腦等組織，SIFT都能以更快的速度獲取高質(zhì)量的圖像。其在空間分辨率和時(shí)間分辨率方面的優(yōu)勢(shì)，使得研究人員能夠更清晰地觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，更及時(shí)地捕捉動(dòng)態(tài)變化。

SIFT對(duì)不同組織透明化方法適應(yīng)性強(qiáng)，在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域應(yīng)用潛力大。雖目前成像速度受相機(jī)等限制，但為ASLM技術(shù)發(fā)展提供重要思路。未來(lái)，靠改進(jìn)相機(jī)、采用更快LFA或優(yōu)化控制信號(hào)等，有望提升其性能，為生物醫(yī)學(xué)研究開(kāi)拓更多可能，助力探索生命奧秘、攻克疾病難題。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：Prince, M.N.H., Garcia, B., Henn, C. et al. Signal improved ultra-fast light-sheet microscope for large tissue imaging. Commun Eng 3, 59 (2024). https://doi.org/10.1038/s44172-024-00205-4.