如何在體外研究心血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞詳解

內(nèi)皮細胞(EC) 是排列在血管內(nèi)表面的特殊細胞，形成連續(xù)的單細胞層。因此，它們是血管壁的一部分，在控制血流和周圍組織之間的物質(zhì)交換方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。EC 根據(jù)其在循環(huán)系統(tǒng)中的位置（如動脈、靜脈、毛細血管和淋巴管）進一步細分。在這篇文章中，我們探討了 EC 的功能，重點關(guān)注心血管系統(tǒng)的 EC。具體來說，我們將研究如何在體外研究 EC在血管生成、屏障形成、欠流和炎癥方面的作用。

ECs在血管生成中的作用

血管生成是新血管生長的過程。因此，它在發(fā)育生物學(xué)、傷口愈合以及腫瘤生長中發(fā)揮著作用（圖1）。血管生成本身由多個步驟組成，包括：

• EC增殖

• 定向遷移（通常通過趨化性）

• 管形成和管腔化

• 成熟：融合、重塑、次級細胞（例如周細胞和血管平滑肌細胞）的募集

這些步驟共同促進了整個血管生成過程，即從現(xiàn)有血管形成新血管[2]。毫無疑問，血管生成是非常復(fù)雜的。為了全面了解整個過程，我們需要檢查各個組成部分。采用體外測定使科學(xué)家能夠?qū)Ｗ⒂谘�管生成過程的特定組成部分，從而促進更加受控和詳細的分析。

圖 1. 研究血管生成過程，例如血管萌芽和趨化性，對于了解腫瘤血管化至關(guān)重要。

應(yīng)用示例1：闡明間隙連接在EC遷移中的作用

Mannell 等人的這項研究。2021 研究了間隙連接蛋白 connexin 43 (Cx43) 在 EC 遷移和血管生成中的作用。研究小組表明，在人微血管內(nèi)皮細胞（HMEC）中通過siRNA敲低Cx43可減少細胞遷移（圖2）。從機制上講，該小組表明 Cx43 功能是通過與酪氨酸磷酸酶 SHP-2 相互作用介導(dǎo)的 [3]。

為了研究 EC 遷移中的 CX43，將 ibidi 培養(yǎng)插件放置在 µ-Slide 8 孔中，如之前的研究所述，以評估遷移速度和方向性 [3]。

該小組共同表明，EC 遷移和血管生成需要 Cx43，并且這是由 SHP-2介導(dǎo)的。

圖 2. 遷移 HMEC 的代表性單細胞痕跡顯示，敲低 Cx43 siRNA 后遷移減少。The figure was reproduced under CC BY 4.0 from Mannell et al. 2021 [3] Figure 1D.

屏障形成中的 EC

血管中EC的單細胞層對于在血液和周圍組織之間形成屏障（最著名的是血腦屏障 (BBB)）的功能至關(guān)重要。EC通過多種途徑主動調(diào)節(jié)化合物轉(zhuǎn)運，包括細胞旁水途徑、跨細胞親脂途徑、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用、載體介導(dǎo)的流入和吸附轉(zhuǎn)胞吞作用（圖3 ）。

了解 EC 屏障的功能和機制是一個受到高度研究的研究領(lǐng)域，因為它在藥物輸送、藥理學(xué)、毒理學(xué)和腫瘤學(xué)中具有重要意義。

圖 3. EC（洋紅色）在屏障形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用， Figure was reproduced under CC BY 4.0 license from Kugler et al., 2021 [5]

應(yīng)用實例2：血腦屏障體外模型的建立

Choublier 等人進行的一項研究中。2021 年 [6]，與研究 BBB 相關(guān)的實驗挑戰(zhàn)得到解決。由于血腦屏障位于大腦中，并且需要恒定、層流和均勻的血流，因此 BBB 存在困難。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，研究人員開發(fā)了一種堅固、低成本的設(shè)備，其中上部通道連接到ibidi 泵系統(tǒng)，以建立培養(yǎng)基的單向再循環(huán)四天，以模擬生理條件。

ibidi 泵系統(tǒng)

Choublier 及其同事表明，該裝置適用于評估屏障功能（圖 4）和研究跨 BBB 的藥物轉(zhuǎn)運。此外，ibidi 泵系統(tǒng)和 µ-Slide 具有評估和復(fù)制腸道或腎臟等人類細胞類型中發(fā)現(xiàn)的障礙的潛力。

建立具有調(diào)節(jié)流量的系統(tǒng)可以在類似體內(nèi)的條件下研究 EC ，這比靜態(tài)系統(tǒng)更好地模擬了真實的生理情況。

圖 4. 在靜態(tài)條件 (a) 和靜態(tài)流動 (b) 下培養(yǎng) 7 天的細胞，顯示內(nèi)皮單層特化。藍色 - 細胞核，綠色 - F-肌動蛋白，黃色 - β-連環(huán)蛋白粘附連接，紅色 - ZO-1 緊密連接。Reproduced under CC BY 4.0 Figure 4 from Choublier et al. in 2021 [6].

EC 流量不足

血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力對 EC 細胞極化、蛋白質(zhì)表達和形態(tài)有直接影響（圖 5）。雖然一個主要研究領(lǐng)域是了解靜態(tài)流如何影響生理 EC，但另一個研究領(lǐng)域是研究擾動流態(tài)如何導(dǎo)致動脈粥樣硬化等疾病。

圖 5. 血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力直接影響細胞極化、蛋白質(zhì)表達和形態(tài)。

應(yīng)用示例 3：解讀線粒體在 EC 健康中的作用

Hong等人的這項工作。2022 [7] 研究了線粒體在維持 EC 穩(wěn)態(tài)和健康中的作用。研究結(jié)果表明，在受到流動干擾的區(qū)域中，線粒體碎片增加，而在單向流動區(qū)域中，細長的線粒體占主導(dǎo)地位。這表明流動模式對線粒體融合/裂變事件具有深遠的影響，影響內(nèi)皮細胞的促炎和代謝狀態(tài)。研究人員利用ibidi 泵系統(tǒng)來研究這些與流動模式相關(guān)的動力學(xué)。

總之，這項研究表明，血流對 EC 健康具有至關(guān)重要的影響，部分原因是線粒體的變化。

炎癥中的內(nèi)皮細胞

全身炎癥對 EC 以及 EC 與其他細胞相互作用的方式有直接影響。一般來說，內(nèi)皮細胞形成的屏障變得更加滲漏[8]，并且炎癥期間免疫細胞滾動、趨化性和跨內(nèi)皮遷移等過程增強（圖5）

圖 5.炎癥過程影響 EC，以及 EC 與其他細胞相互作用的方式。例如，炎癥期間免疫細胞滾動、趨化性和跨內(nèi)皮遷移等過程都會增強。

應(yīng)用實例4：研究導(dǎo)致動脈粥樣硬化的因素

在Forde等人的一項研究中。2020年[9]，研究了促動脈粥樣硬化條件下腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）對人主動脈內(nèi)皮細胞（HAEC）的影響。結(jié)果表明，TRAIL 將暴露于振蕩剪切應(yīng)力的 HAEC 中的基因表達轉(zhuǎn)向抗氧化模式，從而具有血管保護作用。此外，TRAIL 顯著減少暴露于 TNF-α 和高血糖的 HAEC 中活性氧 (ROS) 的形成。這些發(fā)現(xiàn)表明 TRAIL 通過減少氧化應(yīng)激對內(nèi)皮細胞具有動脈粥樣硬化保護作用。

本研究使用 ibidi 泵系統(tǒng) 和 ibidi 通道玻片建立了最先進的促動脈粥樣硬化振蕩剪切應(yīng)力培養(yǎng)模型，已知該模型可促進動脈粥樣硬化形成 [10]。

在這篇文章中，我們探討了心血管系統(tǒng)中的 EC 以及體外研究 EC 的意義。我們的目的是了解 EC 在不同生理環(huán)境中的作用，這使我們認識到不僅 EC 的規(guī)格和狀態(tài)很重要，而且它們的環(huán)境也很重要。

通過在受控條件下進行研究，體外研究為僅通過體內(nèi)實驗難以或不可能探索的過程提供了有價值的見解。通過檢查血管生成、屏障形成、流體和炎癥等各種機制和過程，我們強調(diào)了體外研究的價值。

 

 

參考

[1] Krüger-Genge A, Blocki A, Franke RP, Jung F. Vascular Endothelial Cell Biology: An Update. Int J Mol Sci. 2019 Sep 7;20(18):4411. doi: 10.3390/ijms20184411. 

[2] Adair TH, Montani JP. Angiogenesis. San Rafael (CA): Morgan & Claypool Life Sciences; 2010. Chapter 1, Overview of Angiogenesis. 

[3] Mannell H, Kameritsch P, Beck H, Pfeifer A, Pohl U, Pogoda K. Cx43 Promotes Endothelial Cell Migration and Angiogenesis via the Tyrosine Phosphatase SHP-2. Int J Mol Sci. 2021 Dec 28;23(1):294. doi: 10.3390/ijms23010294. 

[4] Kameritsch P, Kiemer F, Mannell H, Beck H, Pohl U, Pogoda K. PKA negatively modulates the migration enhancing effect of Connexin 43. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2019 May;1866(5):828-838. doi: 10.1016/j.bbamcr.2019.02.001.

[5] Kugler EC, Greenwood J, MacDonald RB. The "Neuro-Glial-Vascular" Unit: The Role of Glia in Neurovascular Unit Formation and Dysfunction. Front Cell Dev Biol. 2021 Sep 27;9:732820. doi: 10.3389/fcell.2021.732820.

[6] Choublier N, Müller Y, Gomez Baisac L, Laedermann J, de Rham C, Declèves X, Roux A. Blood–Brain Barrier Dynamic Device with Uniform Shear Stress Distribution for Microscopy and Permeability Measurements. Appl. Sci. 2021 Nov; 11(12):5584. doi.org/10.3390/app11125584 

[7] Hong SG, Shin J, Choi SY, Powers JC, Meister BM, Sayoc J, Son JS, Tierney R, Recchia FA, Brown MD, Yang X, Park JY. Flow pattern-dependent mitochondrial dynamics regulates the metabolic profile and inflammatory state of endothelial cells. JCI Insight. 2022 Sep 22;7(18):e159286. doi: 10.1172/jci.insight.159286. 

[8] Obermeier B, Daneman R, Ransohoff RM. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 2013 Dec;19(12):1584-96. doi: 10.1038/nm.3407.

[9] Forde H, Harper E, Rochfort KD, Wallace RG, Davenport C, Smith D, Cummins PM. TRAIL inhibits oxidative stress in human aortic endothelial cells exposed to pro-inflammatory stimuli. Physiol Rep. 2020 Oct;8(20):e14612. doi: 10.14814/phy2.14612. 

[10] Davies PF. Hemodynamic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2009 Jan;6(1):16-26. doi: 10.1038/ncpcardio1397. 

 

 

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