多組學(xué)（表觀組+轉(zhuǎn)錄組+微生物組）關(guān)聯(lián)分析及組學(xué)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法

生物過程具有復(fù)雜性和整體性，單組學(xué)數(shù)據(jù)難以系統(tǒng)全面解析復(fù)雜生理過程的分子調(diào)控機(jī)制。而多組學(xué)（Multi-omics）聯(lián)合分析可同時(shí)實(shí)現(xiàn)從“因”和“果”兩個(gè)層面研究生物學(xué)問題，并對其相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證。高通量技術(shù)的發(fā)展，通過對多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析，已成為科學(xué)家探索生命機(jī)制的新方向。

多組學(xué)研究是探究生物系統(tǒng)中多種物質(zhì)之間互作的方法，包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、微生物組學(xué)等，這些物質(zhì)共同影響生命系統(tǒng)的表型、性狀等。

什么是多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析？
關(guān)聯(lián)分析是一種實(shí)用的分析技術(shù)，就是發(fā)現(xiàn)存在于大量數(shù)據(jù)集中的關(guān)聯(lián)性或相關(guān)性，從而描述一個(gè)事物中某些屬性同時(shí)變化的規(guī)律和模式。
需要特別注意的是：相關(guān) ≠ 因果；相關(guān) ≠ 必然
因果關(guān)系的論證一般需要嚴(yán)密的分子實(shí)驗(yàn)。
  圖示：分子的相互作用，產(chǎn)生關(guān)聯(lián)
 
組學(xué)技術(shù)及其關(guān)聯(lián)性
不同組學(xué)
① 表觀組（差異表觀分子特征）：甲基化、組蛋白修飾、開放染色質(zhì)區(qū)、lncRNA、circleRNA、miRNA... ...
② 轉(zhuǎn)錄組（差異基因表達(dá)）：mRNA
③ 蛋白組（差異蛋白）：蛋白質(zhì)
④ 代謝組（差異代謝物）：代謝物
⑤ 微生物組（差異菌群）：菌群結(jié)構(gòu)
多組學(xué)關(guān)聯(lián)的意義：串聯(lián)證據(jù)，互相驗(yàn)證，從不同的角度合力探索和解釋生物學(xué)問題
判斷組學(xué)之間是否可以進(jìn)行關(guān)聯(lián)：是否有關(guān)聯(lián)的生物學(xué)理論基礎(chǔ)。
如：
• 啟動子區(qū)甲基化會抑制基因的表達(dá)。
• 基因主體甲基化與基因表達(dá)正相關(guān)。
• 開放染色質(zhì)狀態(tài)與基因表達(dá)有關(guān)。
• 蛋白質(zhì)是mRNA翻譯的產(chǎn)物。
• miRNA可與mRNA相互作用影響其表達(dá)和翻譯
 
關(guān)聯(lián)分析的主要套路
基于參考文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫：項(xiàng)目異質(zhì)性強(qiáng)，Case by Case 模式
基于代謝通路等已知數(shù)據(jù)庫：高度依賴已知代謝網(wǎng)絡(luò)解讀深度，無法探索未知
基于統(tǒng)計(jì)學(xué)：數(shù)據(jù)最樸質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征解析，可以獲取未知信息，甚至可以為拓展新的知識體系提供幫助
   
易基因主要表觀組學(xué)技術(shù)分類

• DNA甲基化/羥甲基化位點(diǎn)/區(qū)域
• RNA甲基化位點(diǎn)/區(qū)域
• 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)、組蛋白結(jié)合區(qū)
• DNase超敏位點(diǎn)、開放染色質(zhì)區(qū)

 
多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析方法
（1） 直接關(guān)聯(lián)
一個(gè)基因的功能元件甲基化情況影響該基因的表達(dá)。
• 重疊分析
• Pearson/Spearman 相關(guān)性分析
（2）模型關(guān)聯(lián)
基于基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)、代謝物等之間的上下游相互作用聯(lián)系。
• 多元線性模型(multiple linear model)
（3）網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)
基于分子功能和通路的富集性。
• WGCNA module correlation
• EMDN algorithm
• SNF algorithm
 
多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析方法圖例
（1）直接關(guān)聯(lián)
① 重疊分析
特點(diǎn)：簡單粗暴，也適用于樣本量少的情況。
分析結(jié)果：韋恩圖。
圖例：WGBS + total RNA-seq，含DMR的差異表達(dá)基因、差異miRNA靶向的差異表達(dá)基因、差異siRNA靶向的差異表達(dá)基因三者之間的重疊關(guān)系分析
關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：DNA甲基化、miRNA和siRNA協(xié)同作用調(diào)控基因表達(dá)。
 
② 皮爾森/斯皮爾曼相關(guān)性分析
特點(diǎn)：準(zhǔn)確計(jì)算相關(guān)性程度（R值），及其顯著性（p值）。
分析結(jié)果：散點(diǎn)圖（+擬合線）、相關(guān)性熱圖 圖例：血液組織RRBS+RNA-seq，DMR的甲基化水平與差異表達(dá)的表達(dá)水平之間的皮爾森關(guān)聯(lián)分析。

關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：DNA甲基化可直接調(diào)控基因表達(dá)。
圖例：腸道宏基因組+宏病毒組，健康與炎癥性腸�。║C）組分別計(jì)算噬菌體與細(xì)菌豐度之間的皮爾森相關(guān)性并發(fā)現(xiàn)差異。
關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：噬菌體可侵染細(xì)菌進(jìn)而影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)。 圖例：胚胎scRNA-seq+蛋白質(zhì)組，兩連續(xù)發(fā)育階段之間的RNA和表蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性分析。

關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯具有上下游關(guān)系。 關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：腸道中有多類菌群可直接產(chǎn)生短鏈脂肪酸這類益生物質(zhì)。
 
（2）模型關(guān)聯(lián)
回歸分析（regression analysis)是確定兩組或兩組以上變量間關(guān)系的統(tǒng)計(jì)方法。回歸分析按照變量的數(shù)量分為一元回歸和多元回歸。兩個(gè)變量使用一元回歸，兩個(gè)以上變量使用多元回歸。
多元線性回歸模型(multiple linear model) 特點(diǎn)：基于基因表達(dá)、蛋白質(zhì)、代謝物等之間的直接和間接相互作用聯(lián)系。

分析結(jié)果：關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖
圖例：腸道菌群16S+血液代謝組+肝臟轉(zhuǎn)錄組，通過多元線性模型關(guān)聯(lián)分析，篩選出若干優(yōu)秀模型，組建低劑量抗生素飼喂促進(jìn)仔豬快速生長的多組學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：腸道菌群可通過產(chǎn)生代謝物進(jìn)入血液，運(yùn)輸至肝臟影響肝臟細(xì)胞的基因表達(dá)。

（3）網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)
細(xì)胞內(nèi)所有大分子相互作用的集合，稱為相互作用組（Interactome），是大多數(shù)基因型與表型關(guān)系的基礎(chǔ)，可以用來指導(dǎo)解釋組學(xué)技術(shù)檢測到的變化如何干擾整個(gè)機(jī)體。
機(jī)體的分子響應(yīng)和變化具有功能富集性、通路富集性。因此不同組學(xué)檢測數(shù)據(jù)也具有相似的功能富集性和變化規(guī)律。
網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)算法正是基于這些生物學(xué)理論基礎(chǔ)。

• 基于WGCNA的共變關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA module correlation)
• 基于表觀模塊的差異網(wǎng)絡(luò)分析（EMDN algorithm）
• 相似性網(wǎng)絡(luò)融合分析（SNF algorithm）

 
分析結(jié)果：關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖

• ①基于WGCNA的共變關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析
  • 利用組間差異基因鑒定共甲基化和共表達(dá)模塊。
  • 模塊-模塊相關(guān)性、模塊表型相關(guān)性可以有效識別具有功能富集性的多組學(xué)變化模塊。

圖例：血液組織RRBS + RNA-seq，基因的差異甲基化模式與基因表達(dá)模式的共變關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析。

• 前期直接關(guān)聯(lián)得到的基因很少；
• 改變策略，采用基于WGCNA的共變關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，得到的共甲基化和共表達(dá)基因均富集于自噬相關(guān)通路。

關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：基因組DNA的甲基化與基因表達(dá)變化具有功能富集性。
 
圖例：腸道宏基因組+代謝組，不同管理狀態(tài)下川金絲猴糞便代謝物與腸道菌群基于WGCNA的共變關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析。

• 鑒定了2對強(qiáng)正相關(guān)的物種和代謝物的共變化模塊。
• 圈養(yǎng)條件的代表性模塊中發(fā)現(xiàn)了潛在致病菌和相關(guān)代謝物。

關(guān)聯(lián)理論基礎(chǔ)：腸道菌群可響應(yīng)環(huán)境變化改變腸道微環(huán)境中相關(guān)的代謝產(chǎn)物的濃度。
 

•  基于表觀模塊的差異網(wǎng)絡(luò)分析（EMDN algorithm）
  • 利用組間差異基因鑒定共甲基化（共表達(dá)）模塊。
  • 差異共甲基化（差異共表達(dá)）網(wǎng)絡(luò)篩選。
  • 從多個(gè)差異共變網(wǎng)絡(luò)中篩選共同網(wǎng)絡(luò)。

圖例：基于表觀模塊的差異網(wǎng)絡(luò)分析（EMDN algorithm）
 
 
 

• 相似性網(wǎng)絡(luò)融合分析 (SNF algorithm）

圖例：

• SNF算法(圖1d)使用了一種基于信息傳遞理論的非線性算法，該方法迭代更新每個(gè)網(wǎng)絡(luò)，使其與其他網(wǎng)絡(luò)更加相似。經(jīng)過幾次迭代之后，SNF收斂到單個(gè)網(wǎng)絡(luò)中。
• 算法的優(yōu)點(diǎn)是，弱相似性(低權(quán)重的邊)消失，有助于降低噪聲，而在一個(gè)或多個(gè)網(wǎng)絡(luò)中存在的強(qiáng)相似性(高權(quán)重的邊)被添加到其他網(wǎng)絡(luò)中。

圖例：融合網(wǎng)絡(luò)三個(gè)cluster內(nèi)部的連接性、緊密性和cluster之間相對較少的邊界，說明該算法可以更清晰地顯示多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)患者的分型情況。
 

• 其他網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析方法

從關(guān)聯(lián)走向因果：組學(xué)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
基因表達(dá)相關(guān)的組學(xué)：

• 基因敲除/抑制
• 基因過表達(dá)

甲基化組學(xué)：

• 甲基化酶基因的敲除與過表達(dá)

宏基因組（腸道菌群）：

• 無菌動物模型
• 糞菌移植

以上是關(guān)于多組學(xué)分析方法及組學(xué)分子實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的解析。

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