煙臺(tái)海岸帶所利用蛋白組+磷酸化修飾組學(xué)揭示TDCIPP毒理機(jī)制

磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯 (TDCIPP)是一種典型的有機(jī)磷污染物，在水環(huán)境中廣泛存在。先前研究表明，TDCIPP通過蛋白磷酸化來發(fā)揮多重毒性，但是其中機(jī)理尚不明確。

2022年7月15日，國(guó)際頂尖環(huán)境科學(xué)期刊Journal of Hazardous Materials（IF 14.224）在線發(fā)表了中科院煙臺(tái)海岸帶研究所吉成龍等老師的創(chuàng)新研究成果“Toxicological effects of tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate in oyster Crassostrea gigas using proteomic and phosphoproteomic analyses”。該研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾組學(xué)，結(jié)合傳統(tǒng)方法對(duì)不同濃度TDCIPP處理的牡蠣進(jìn)行毒理效應(yīng)研究。組學(xué)分析顯示，TDCIPP通過直接磷酸化關(guān)鍵蛋白或上游信號(hào)通路來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、能量代謝、細(xì)胞凋亡和增殖，讓我們對(duì)TDCIPP的毒理機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。中科新生命提供了蛋白質(zhì)組和磷酸化修飾組檢測(cè)服務(wù)。
 

研究材料

牡蠣
 

技術(shù)路線

步驟1：TDCIPP生物濃度；

步驟2：消化腺組織學(xué)變化；

步驟3：關(guān)鍵酶活性檢測(cè)；

步驟4：蛋白質(zhì)組學(xué)分析；

步驟5：磷酸化修飾組學(xué)分析。

研究結(jié)果

1. TDCIPP生物濃度

與對(duì)照組相比，5和50 μg/L TDCIPP處理組牡蠣中TDCIPP含量顯著積累 (圖1)。

圖1 不同處理組牡蠣的TDCIPP積累

 

2. 消化腺組織學(xué)變化

H&E染色顯示對(duì)照組消化管腔呈十字形，消化細(xì)胞高，管腔窄，消化管上皮厚。TDCIPP處理組的上皮細(xì)胞較薄，管腔較寬，消化管管腔由十字形變?yōu)閳A形，最高濃度(50 μg/L)處理組的消化細(xì)胞發(fā)生脫落（圖2）。
 

圖2 牡蠣消化腺的石蠟切片

隨著TDCIPP劑量的增加，消化管MLR/MET比值增加，其中50 μg/L TDCIPP處理組的牡蠣樣品MLR/MET值最高；5 μg/L TDCIPP處理組次之(圖3)。

圖3 不同處理組消化腺M(fèi)LR/MET值

 

3.  關(guān)鍵酶活性檢測(cè)

CAT和GST活性在對(duì)照組和TDCIPP暴露組間無(wú)顯著差異。AChE的活性呈底部變化。在caspase-9活性方面，只有50 μg/L TDCIPP處理組顯著高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，TDCIPP治療組caspase-3活性無(wú)顯著變化（圖4）。

圖4 TDCIPP暴露后消化腺的酶活性

 

4. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

從牡蠣消化腺樣本中共鑒定出6705個(gè)蛋白質(zhì)。與對(duì)照組相比，50 μg/L TDCIPP處理組的牡蠣共有551個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)（DEPs），其中上調(diào)蛋白259個(gè)，下調(diào)蛋白292個(gè)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)（圖5A），大多數(shù)DEPs位于細(xì)胞內(nèi)(74)，參與代謝過程(147)和細(xì)胞過程(114)，分子功能主要集中在催化活性(168)和結(jié)合活性(131)。KEGG通路分析顯示（圖5B），上調(diào)的注釋蛋白在脂類和氨基酸的代謝過程中富集，下調(diào)的注釋蛋白在三個(gè)Hippo信號(hào)通路等中富集。其中，谷胱甘肽代謝通路覆蓋最多DEPs(8)；最顯著富集通路是維生素B6代謝；其他富集的KEGG通路與代謝過程有關(guān)。

圖5 50μg/L TDCIPP處理的消化腺中DEPs的GO富集柱狀圖(A)和KEGG通路富集氣泡圖(B)

 

5. 磷酸化修飾組學(xué)分析

在牡蠣消化腺中，共鑒定出850個(gè)磷酸化蛋白，152個(gè)蛋白被差異磷酸化。GO分析顯示（圖6A），在生物過程中，富集程度最高的是含蛋白復(fù)合體和細(xì)胞含蛋白復(fù)合體。大多數(shù)DPPs的分子功能是核酸結(jié)合(21)。細(xì)胞成分大多位于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體(3)、DNA包裝復(fù)合體(3)和核小體(3)中。KEGG通路分析顯示（圖6B），在MAPK信號(hào)通路、病灶黏附和TCA循環(huán)中，磷酸化蛋白高度富集。在50 μg/L TDCIPP處理組中，病灶粘連通路覆蓋的DPPs最多(5)。最顯著富集通路的是丙酮酸代謝。其他的富集通路參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和能量代謝通路。將鑒定的DEPs與DPPs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在兩者間并未出現(xiàn)重疊蛋白，但KEGG分析表明，在TDCIPP處理后，DEPs和DPPs都參與了信號(hào)通路。

圖6 50 μg/L TDCIPP處理的消化腺中DPPs的GO富集柱狀圖(A)和KEGG通路富集氣泡圖(B)

 

小編小結(jié)

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)+磷酸化修飾組學(xué)，結(jié)合生化數(shù)據(jù)和組織學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)TDCIPP具有刺激性神經(jīng)毒素，會(huì)破壞細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。高濃度的TDCIPP可通過直接磷酸化關(guān)鍵蛋白或其上游信號(hào)通路導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、能量代謝、細(xì)胞凋亡和增殖等過程發(fā)生異常。