Evosep在FFPE 腫瘤活檢臨床生物標志物定量的靈敏度研究中的應(yīng)用
標題：High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies
期刊：bioRxiv
發(fā)表日期：2022- 02-10
Abstract:
Mass spectrometry-based targeted proteomics allows objective protein quantitation of clinical biomarkers from a single section of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue biopsies. We combined high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) and parallel reaction monitoring (PRM) to increase assay sensitivity. The modular nature of the
FAIMS source allowed direct comparison of the performance of FAIMS-PRM to PRM. Limits of quantitation were determined by spiking synthetic peptides into a human spleen matrix. In addition, 20 clinical samples were analyzed using FAIMS-PRM and the quantitation of HER2 was compared with that obtained with the Ventana immunohistochemistry assay. FAIMS-PRM improved the overall signal-to-noise ratio over that from PRM and increased assay sensitivity in FFPE tissue analysis for four (HER2, EGFR, cMET, and KRAS) of five proteins of clinical interest. FAIMS-PRM enabled sensitive quantitation of basal HER2 expression in breast cancer samples classified as HER2 negative by immunohistochemistry. Furthermore, we determined the degree of FAIMS-dependent background reduction and showed that this correlated with an improved lower limit of quantitation with FAIMS. FAIMS-PRM is anticipated to benefit clinical trials in which multiple biomarker questions must be addressed and the availability of tumor biopsy samples is limited.
研究背景
在靶向治療中，主要藥物靶點的表達水平通常與患者對治療的臨床反應(yīng)相關(guān)，因此可作為預(yù)測性生物標志物�；顧z樣本中蛋白質(zhì)生物標記物的定量分析通常用于評估臨床用藥的藥效學效果。IHC是臨床試驗中藥效學評估的標準方法，但IHC方法存在一定的局限性。基于質(zhì)譜（MS）的選擇性反應(yīng)監(jiān)測靶向蛋白質(zhì)組學（SRM）已成為克服IHC局限性的一種有前途的蛋白質(zhì)定量技術(shù)。
在使用基于SRM的HER2測量的臨床試驗報告中，預(yù)測曲妥珠單抗療效的HER2表達水平的臨床臨界值由SRM讀數(shù)確定。SRM方法具有高靈敏度，然而，在分析高復(fù)雜性臨床樣本時，SRM方法的靈敏度會受到影響，目前已通過使用平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）來利用高分辨率質(zhì)量分析儀來解決。當分析中存在高水平的非特異性背景信號時，PRM是有利的，這在涉及福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤活檢的臨床分析中是常見的。迄今為止，F(xiàn)AIMS在PRM的Orbitrap儀器上的應(yīng)用已存在，但沒有對FAIMS的益處進行廣泛描述。在此，作者對FAIMS-PRM方法進行了系統(tǒng)評估，該方法結(jié)合離子遷移率和高分辨率Orbitrap質(zhì)量分析儀，以實現(xiàn)腫瘤臨床研究中關(guān)鍵生物標記物的高靈敏度定量。
研究方法
1. 合成肽制劑
所有肽都是由生物化學公司合成的輕肽和重肽對。重肽用C末端R[13C615N4]或K[13C615N2]標記，同位素富集率大于99%。對于半胱氨酸，使用氨基甲基化半胱氨酸。通過HPLC進一步純化合成肽，以達到95%以上的純度，并通過氨基酸分析驗證凈肽含量。
2. 臨床樣品制備
來自乳腺癌患者的FFPE腫瘤活檢樣本，由認證醫(yī)學病理學家在機構(gòu)審查委員會批準下收集。每個樣本制作三個組織切片，用于蘇木精和伊紅（H＆E）染色、HER2 IHC和激光顯微切割（LMD）。
3. 圖像分析和LMD
研究病理學家對H＆E染色的玻片進行激光顯微切割腫瘤上皮的病理學評估，這些玻片在掃描儀上用光學掃描鏡進行數(shù)字成像。HALO AI用于對載玻片進行分類和注釋，以指導(dǎo)腫瘤上皮的LMD。
4. LC-MS分析的樣品處理
從載玻片上采集的顯微解剖組織樣品在0.1%RapiGest中溶解，在95°C下孵育90分鐘，在37°C下與氯乙酰胺烷基化，然后進行過夜胰蛋白酶消化。
5. LC-MS數(shù)據(jù)采集
脫鹽樣品（1.2µg）與合成同位素標記肽（6 fmol）結(jié)合。將該混合物的六分之五裝載到EvoTip上，然后使用EvoSep One nanoLC系統(tǒng)分離，該系統(tǒng)與帶有FAIMS-PRO接口的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀耦合。肽在44 min梯度上從7%到30%乙腈（柱上）以500 nL/min的流速洗脫。FAIMS-PRM實驗采用高能碰撞離解（HCD）碎裂，隔離窗口為0.7質(zhì)量電荷比（m/z），目標自動增益控制為1E6離子，最大注入時間為100 ms。串聯(lián)ms（ms/ms）掃描是在質(zhì)心模式下使用Orbitrap探測器獲得的，分辨率為30K，分辨率為200 m/z。FAIMS以標準分辨率運行，沒有額外的FAIMS氣體。
6. 數(shù)據(jù)分析
PRM數(shù)據(jù)使用Skyline，采用高選擇性提取進行分析。通過手動分析，比較內(nèi)源性肽和參考肽的共溶率和片段離子比率，確定存在干擾的片段離子。任何顯示干擾的片段離子都被標記，并在定量中省略。
研究結(jié)果及討論
1. 將FAIMS集成到PRM方法中
在這項研究中，作者選擇了代表HER2、EGFR、ER、cMET和KRAS的10個肽。為了確定傳輸最大離子通量的最佳FAIMS CV，在直接注入合成肽的情況下，掃描每個前體的CV范圍。EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前體的最佳透射率在–62至–58 V之間，最大強度的一半為–72至–52 V（圖1A）。將每個前體確定的最佳CV值集成到最終計劃的PRM方法中，10種肽的FAIMS CV范圍為–28至–58 V。此外，作者還對前驅(qū)體隔離寬度和MS/MS分辨率進行了進一步優(yōu)化。比較了0.4、0.7和1.6 m/z的前體分離寬度：選擇0.7 m/z作為減少干擾和保持目標肽信號之間的首選平衡。比較了30K（64 MS瞬態(tài)長度）、60K（128 MS）和120K（256 MS）的MS/MS分辨率：高分辨率數(shù)據(jù)采集所需的額外掃描時間似乎無法充分減少干擾。較高分辨率的采集也會導(dǎo)致較低的碎片離子信號，因此首選30K分辨率。
2. FAIMS-PRM的性能檢測
為了評估FAIMS整合到PRM方法中的影響，在胰蛋白酶消化、福爾馬林固定的人脾臟中測定了使用和不使用FAIMS獲得的PRM分析的定量限（LOQ）。在有無FAIMS的情況下，分別在兩個不同的場合采集了四條LOQ曲線和192個原始文件的LOQ曲線。在11種前體中，7種在添加FAIMs后LLOQ降低了三倍。對于所有前體，不含F(xiàn)AIMS的PRM實驗的平均LLOQ為137 amol/µg；使用FAIMS，這一含量降低到46 amol/µg。對于全套碎片離子，37個有FAIMS的LLOQ最低，30個平均，4個沒有FAIMS的LLOQ最低。圖1C和1D顯示了摻入脾臟基質(zhì)并通過FAIMS-PRM與PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽的MS/MS光譜。在這種低水平下，PRM-MS/MS數(shù)據(jù)顯示總離子計數(shù)較高（3.9 E5），包括干擾背景離子，但FAIMS-PRM-MS/MS顯示出更清晰的光譜，總離子計數(shù)較低（9.9 E4）四倍，來自IPLENLQIIR前體的碎片離子相對強度較高。
圖1E和1F顯示了通過PRM與FAIMS-PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽片段離子的提取離子色譜圖（XIC）。當使用FAIMS獲取PRM時，即使使用高分辨率（30K）Orbitrap檢測（圖1F），PRM中檢測到的干擾也會被消除（圖1E）。
期刊：bioRxiv
發(fā)表日期：2022- 02-10
Abstract:
Mass spectrometry-based targeted proteomics allows objective protein quantitation of clinical biomarkers from a single section of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tumor tissue biopsies. We combined high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) and parallel reaction monitoring (PRM) to increase assay sensitivity. The modular nature of the
FAIMS source allowed direct comparison of the performance of FAIMS-PRM to PRM. Limits of quantitation were determined by spiking synthetic peptides into a human spleen matrix. In addition, 20 clinical samples were analyzed using FAIMS-PRM and the quantitation of HER2 was compared with that obtained with the Ventana immunohistochemistry assay. FAIMS-PRM improved the overall signal-to-noise ratio over that from PRM and increased assay sensitivity in FFPE tissue analysis for four (HER2, EGFR, cMET, and KRAS) of five proteins of clinical interest. FAIMS-PRM enabled sensitive quantitation of basal HER2 expression in breast cancer samples classified as HER2 negative by immunohistochemistry. Furthermore, we determined the degree of FAIMS-dependent background reduction and showed that this correlated with an improved lower limit of quantitation with FAIMS. FAIMS-PRM is anticipated to benefit clinical trials in which multiple biomarker questions must be addressed and the availability of tumor biopsy samples is limited.
研究背景
在靶向治療中，主要藥物靶點的表達水平通常與患者對治療的臨床反應(yīng)相關(guān)，因此可作為預(yù)測性生物標志物�；顧z樣本中蛋白質(zhì)生物標記物的定量分析通常用于評估臨床用藥的藥效學效果。IHC是臨床試驗中藥效學評估的標準方法，但IHC方法存在一定的局限性。基于質(zhì)譜（MS）的選擇性反應(yīng)監(jiān)測靶向蛋白質(zhì)組學（SRM）已成為克服IHC局限性的一種有前途的蛋白質(zhì)定量技術(shù)。
在使用基于SRM的HER2測量的臨床試驗報告中，預(yù)測曲妥珠單抗療效的HER2表達水平的臨床臨界值由SRM讀數(shù)確定。SRM方法具有高靈敏度，然而，在分析高復(fù)雜性臨床樣本時，SRM方法的靈敏度會受到影響，目前已通過使用平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）來利用高分辨率質(zhì)量分析儀來解決。當分析中存在高水平的非特異性背景信號時，PRM是有利的，這在涉及福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤活檢的臨床分析中是常見的。迄今為止，F(xiàn)AIMS在PRM的Orbitrap儀器上的應(yīng)用已存在，但沒有對FAIMS的益處進行廣泛描述。在此，作者對FAIMS-PRM方法進行了系統(tǒng)評估，該方法結(jié)合離子遷移率和高分辨率Orbitrap質(zhì)量分析儀，以實現(xiàn)腫瘤臨床研究中關(guān)鍵生物標記物的高靈敏度定量。
研究方法
1. 合成肽制劑
所有肽都是由生物化學公司合成的輕肽和重肽對。重肽用C末端R[13C615N4]或K[13C615N2]標記，同位素富集率大于99%。對于半胱氨酸，使用氨基甲基化半胱氨酸。通過HPLC進一步純化合成肽，以達到95%以上的純度，并通過氨基酸分析驗證凈肽含量。
2. 臨床樣品制備
來自乳腺癌患者的FFPE腫瘤活檢樣本，由認證醫(yī)學病理學家在機構(gòu)審查委員會批準下收集。每個樣本制作三個組織切片，用于蘇木精和伊紅（H＆E）染色、HER2 IHC和激光顯微切割（LMD）。
3. 圖像分析和LMD
研究病理學家對H＆E染色的玻片進行激光顯微切割腫瘤上皮的病理學評估，這些玻片在掃描儀上用光學掃描鏡進行數(shù)字成像。HALO AI用于對載玻片進行分類和注釋，以指導(dǎo)腫瘤上皮的LMD。
4. LC-MS分析的樣品處理
從載玻片上采集的顯微解剖組織樣品在0.1%RapiGest中溶解，在95°C下孵育90分鐘，在37°C下與氯乙酰胺烷基化，然后進行過夜胰蛋白酶消化。
5. LC-MS數(shù)據(jù)采集
脫鹽樣品（1.2µg）與合成同位素標記肽（6 fmol）結(jié)合。將該混合物的六分之五裝載到EvoTip上，然后使用EvoSep One nanoLC系統(tǒng)分離，該系統(tǒng)與帶有FAIMS-PRO接口的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀耦合。肽在44 min梯度上從7%到30%乙腈（柱上）以500 nL/min的流速洗脫。FAIMS-PRM實驗采用高能碰撞離解（HCD）碎裂，隔離窗口為0.7質(zhì)量電荷比（m/z），目標自動增益控制為1E6離子，最大注入時間為100 ms。串聯(lián)ms（ms/ms）掃描是在質(zhì)心模式下使用Orbitrap探測器獲得的，分辨率為30K，分辨率為200 m/z。FAIMS以標準分辨率運行，沒有額外的FAIMS氣體。
6. 數(shù)據(jù)分析
PRM數(shù)據(jù)使用Skyline，采用高選擇性提取進行分析。通過手動分析，比較內(nèi)源性肽和參考肽的共溶率和片段離子比率，確定存在干擾的片段離子。任何顯示干擾的片段離子都被標記，并在定量中省略。
研究結(jié)果及討論
1. 將FAIMS集成到PRM方法中
在這項研究中，作者選擇了代表HER2、EGFR、ER、cMET和KRAS的10個肽。為了確定傳輸最大離子通量的最佳FAIMS CV，在直接注入合成肽的情況下，掃描每個前體的CV范圍。EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前體的最佳透射率在–62至–58 V之間，最大強度的一半為–72至–52 V（圖1A）。將每個前體確定的最佳CV值集成到最終計劃的PRM方法中，10種肽的FAIMS CV范圍為–28至–58 V。此外，作者還對前驅(qū)體隔離寬度和MS/MS分辨率進行了進一步優(yōu)化。比較了0.4、0.7和1.6 m/z的前體分離寬度：選擇0.7 m/z作為減少干擾和保持目標肽信號之間的首選平衡。比較了30K（64 MS瞬態(tài)長度）、60K（128 MS）和120K（256 MS）的MS/MS分辨率：高分辨率數(shù)據(jù)采集所需的額外掃描時間似乎無法充分減少干擾。較高分辨率的采集也會導(dǎo)致較低的碎片離子信號，因此首選30K分辨率。
2. FAIMS-PRM的性能檢測
為了評估FAIMS整合到PRM方法中的影響，在胰蛋白酶消化、福爾馬林固定的人脾臟中測定了使用和不使用FAIMS獲得的PRM分析的定量限（LOQ）。在有無FAIMS的情況下，分別在兩個不同的場合采集了四條LOQ曲線和192個原始文件的LOQ曲線。在11種前體中，7種在添加FAIMs后LLOQ降低了三倍。對于所有前體，不含F(xiàn)AIMS的PRM實驗的平均LLOQ為137 amol/µg；使用FAIMS，這一含量降低到46 amol/µg。對于全套碎片離子，37個有FAIMS的LLOQ最低，30個平均，4個沒有FAIMS的LLOQ最低。圖1C和1D顯示了摻入脾臟基質(zhì)并通過FAIMS-PRM與PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽的MS/MS光譜。在這種低水平下，PRM-MS/MS數(shù)據(jù)顯示總離子計數(shù)較高（3.9 E5），包括干擾背景離子，但FAIMS-PRM-MS/MS顯示出更清晰的光譜，總離子計數(shù)較低（9.9 E4）四倍，來自IPLENLQIIR前體的碎片離子相對強度較高。
圖1E和1F顯示了通過PRM與FAIMS-PRM分析的46 amol IPLENLQIIR肽片段離子的提取離子色譜圖（XIC）。當使用FAIMS獲取PRM時，即使使用高分辨率（30K）Orbitrap檢測（圖1F），PRM中檢測到的干擾也會被消除（圖1E）。
圖1. F AI MS 對 EGF R I PL ENL QII R [M+ 2 H]2+ 的 PRM 分析的影響
在本研究中，F(xiàn)AIMS降低LLOQ的肽更有可能在基質(zhì)復(fù)雜度較高且非特異性背景信號水平較高的區(qū)域洗脫。當背景離子被過濾掉后，這些肽將在更大程度上受益于FAIMS。每個目標m/z窗口注入的非特定背景離子的平均數(shù)量如圖2A所示。FAIMS降低了所有目標m/z窗口的背景離子（圖2B）。然而，與FAIMS整合后LLOQ降低的七個肽表明，與FAIMS整合后背景離子的降低幅度顯著更大。FAIMS對通過LOQ曲線注入的總離子的影響如EGFR IPLENLQIIR[M+2H]2+前體的補充圖S4所示。加標重肽的貢獻可忽略不計，高達137 amol。從412 amol開始，添加FAIMS重肽后，離子注入中位數(shù)增加。在沒有FAIMS的情況下，由于背景增加，僅從添加3.7 fmol重肽開始，離子注入中位數(shù)顯著增加。圖2. 在LLOQ中具有faims依賴性改善的多肽也具有更大的背景信號降低。
3. FAIMS-PRM在臨床標本中的應(yīng)用
FAIMS-PRM分析在臨床樣本上的性能，我們將該方法應(yīng)用于20例乳腺癌患者的FFPE腫瘤活檢。通過基于AI的圖像分析識別的腫瘤上皮細胞通過LMD收集，以精確測量腫瘤濃度�？傮w工作流如圖3A所示。從20個腫瘤活檢樣本中成功定量了所有靶蛋白。圖 3B 顯示了兩個樣品中 244 和 62 amol/µg 的 EGFR 定量。即使在62 amol水平下，圍繞感興趣峰值的非特異性背景信號的低水平也是明顯的。圖3C中顯示了兩個濃度為5718和210 amol/µg的樣品的HER2定量。使用兩種性能最好的肽ELVSEFSR和SGGGDLTLGLEPSEEEAPR對這些樣本中的HER2水平進行量化，這兩種肽均顯示出與FAIMS整合后的LLOQ改善。獨立于這兩種肽獲得的HER2定量結(jié)果高度相關(guān)（R2=0.991）（圖4A）。
作者將病理學家基于IHC分析得出的HER2表達評分結(jié)果與FAIMS-PRM獲得的腫瘤濃度進行比較。盡管PRM讀數(shù)與IHC分數(shù)有很好的相關(guān)性，但與早期出版物一致，MS定量強調(diào)了相同IHC分數(shù)范圍內(nèi)廣泛的腫瘤濃度（圖4B）。在IHC分類為1+的八個樣品中，有兩個樣品的HER2濃度接近HER2+樣品的中值濃度。這些患者可能是HER2靶向治療的合適人選，F(xiàn)ISH檢測呈陽性。
圖3. FAIMS-PRM臨床蛋白質(zhì)組學工作流程。
研究結(jié)論
本文介紹的FFPE組織樣本的臨床蛋白質(zhì)組學工作流程預(yù)計將對臨床試驗具有很大的實用價值，在這些臨床試驗中，蛋白質(zhì)靶點的復(fù)用可以證明需要解決的機制和藥效學問題。
參考文獻
Sweet, Steve MM, et al. "High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry and Parallel Reaction Monitoring Increases Sensitivity for Clinical Biomarker Quantitation from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tumor Biopsies." bioRxiv(2022).
- 癌癥治療中冷腫瘤與熱腫瘤的區(qū)別及互相轉(zhuǎn)化
- Science論文分享：人工智能工具EVOLVEpro助力設(shè)計更穩(wěn)定高效蛋白質(zhì)
- Nature分享：靶向蛋白降解技術(shù)（TPD）發(fā)展趨勢及四大創(chuàng)新方向
- 哺乳動物細胞瞬時基因表達技術(shù)(TGE)的優(yōu)勢及最新改進策略
- Sprint®蛋白質(zhì)分析儀在酸奶中蛋白質(zhì)含量測定的應(yīng)用
- 合成生物學在新一代生物制造、未來醫(yī)學以及糧食、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用
- 案例分享：單細胞功能蛋白組學應(yīng)用案例集共40多篇高分文章
- Echo聲波移液：合成生物學的DBTL角色
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com