活細胞成像技術(shù)概述、優(yōu)勢及應(yīng)用
活細胞成像是指主要用于捕獲活體、活動狀態(tài)的細胞圖像的技術(shù)，無論是作為單獨的靜態(tài)圖片還是作為延時系列。相應(yīng)地，活細胞成像的技術(shù)應(yīng)用大致可以分為兩類：
1.細胞在自然、存活狀態(tài)下的圖像記錄
2.實時觀察和記錄細胞、組織或整個生物體的動態(tài)過程
活細胞成像的用途
采用活細胞成像的研究一直在上升，這主要是由于部分在熒光標記技術(shù)，電子數(shù)據(jù)處理和光學(xué)技術(shù)的進步。
1960 年代初期綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)以及自 1990 年代以來其許多衍生物的廣泛使用標志著顯微鏡新時代的開始。熒光蛋白的使用，無論是單獨使用還是在產(chǎn)生融合版本的熒光團之后，都可以監(jiān)測細胞和細胞成分，同時可用的蛋白質(zhì)和酶靶標的數(shù)量不斷增加。
事實證明，在細胞生物學(xué)和使用細胞生物學(xué)技術(shù)的領(lǐng)域向前邁出的非常重要的一步是在細胞的存活狀態(tài)下可視化細胞的能力�；罴毎c非活細胞的區(qū)別不僅與生命過程中發(fā)生的變化有關(guān)，也與死亡過程中發(fā)生的變化有關(guān)。生命是結(jié)構(gòu)的涌現(xiàn)屬性，生命過程的停止總是與結(jié)構(gòu)的某些變化有關(guān)，無論因果順序如何。也就是說，無論生命的終止是特定結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果，還是變化是終止的結(jié)果，變化總是存在的。
普通的電子顯微鏡雖然有著較高的分辨率但卻無法可視化活細胞動態(tài)。而活細胞成像技術(shù)可以有效地記錄細胞、組織或整個生物體中發(fā)生的動態(tài)過程。比如細胞成像儀可以清晰地拍攝到細胞分裂過程以及細胞器的運動和轉(zhuǎn)化，被 標記特定細胞器的熒光標記物以及光譜行為的變化也能在細胞成像儀下被記錄。
活細胞成像的重要考慮因素
在使用活細胞成像時，研究人員必須始終牢記，要使該技術(shù)取得成功并產(chǎn)生盡可能準確地反映活細胞狀態(tài)的可用結(jié)果，需要滿足許多條件。細胞。這些包括：正確的培養(yǎng)條件。與任何其他組織培養(yǎng)一樣，活細胞成像需要使用適當?shù)募毎囵B(yǎng)基（包括緩沖液和生長血清）、適當?shù)呐囵B(yǎng)容器和無菌技術(shù)。溫度必須恒定在 37°C。此外，為了抵消代謝產(chǎn)物引起的酸化并保持 pH 值 7.4，使用了碳酸氫鹽 (HCO 3 – ) 和溶解的二氧化碳 (CO 2 )的緩沖系統(tǒng)，并將適當?shù)恼{(diào)節(jié)器提供的氣體連接到顯微鏡培養(yǎng)箱. 如果沒有 CO 2如果可用，也可以使用含有 10–20 mM HEPES 的緩沖液。
培養(yǎng)基中的酚紅是監(jiān)測 pH 值的常用方法。培養(yǎng)容器的選擇也很重要。細胞通常在塑料上生長得更好，但玻璃在高倍率下可提供更高的光學(xué)質(zhì)量。另一方面，玻璃通常需要用諸如聚 -L-賴氨酸或聚-L-鳥氨酸之類的基材涂覆。細菌污染始終是一個問題，因此幾乎總是使用抗生素。如果特定方案要求避免使用抗生素，則培養(yǎng)物的制備和維護過程中的護理變得更加重要。
保護細胞免受光毒性。由于光毒性，使用熒光成像可能對細胞穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生潛在的有害影響，光毒性可能來自不同的來源。細胞內(nèi)的有機分子如卟啉、黃素等能吸收光，與氧反應(yīng)降解，釋放出超氧自由基、羥基自由基、過氧化氫等活性氧，對細胞造成損傷。熒光染料本身也會產(chǎn)生自由基，因為它們在處于激發(fā)態(tài)時會與氧氣發(fā)生反應(yīng)。可以通過實施一些簡單但有效的措施來避免光毒性。這包括：
(1) 使用具有較低能量（較長波長）激發(fā)光譜的熒光團，
(2) 使用盡可能低的光強度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時間，適當?shù)膸�。在觀察不斷變化的事件時，調(diào)查員需要確保圖像幀速率適合跟蹤這些事件。太低的幀速率意味著時間分辨率的損失和記錄文件中感興趣的過程的較差表示。另一方面，過高的幀速率會增加光毒性的風(fēng)險并導(dǎo)致生成更大的文件。
但是，如果要記錄的事件的速度如此之高以至于所需的幀速率導(dǎo)致光毒性怎么辦？在這種情況下，必須降低激發(fā)光強度—— 但這會導(dǎo)致圖像變暗�？梢栽黾酉鄼C的增益以補償?shù)凸�，但這意味著噪聲水平也會增加，從而降低圖像的質(zhì)量和準確性。增加相機靈敏度，為了在較低的激發(fā)光強度和較低的增益下使用所需的幀速率獲得令人滿意的結(jié)果，在這種情況下比較有幫助的。
高速顯微鏡儀器的重要性
活細胞成像用于記錄各種事件，并且在制作延時序列時，幀速率必須適當。例如，在記錄細胞分裂時，事件可能在幾分鐘內(nèi)發(fā)生，如在一些果蠅胚胎中，或在 24 小時內(nèi)發(fā)生，如在快速分裂的哺乳動物細胞中。當然，有些細胞需要更長的時間才能分裂，但這些與我們無關(guān)。在所有這些例子中，低幀率 ——每幾秒甚至每幾分鐘一次——就足夠了。在光譜的另一端，有非�？斓氖录缗c細胞通訊相關(guān)的事件（即動作電位觸發(fā)和細胞內(nèi)鈣信號事件）。使用適當?shù)臅r間分辨率可以精確計時現(xiàn)象及其在多細胞神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生的級聯(lián)事件中的位置。電生理膜片鉗等技術(shù)可以在細胞水平上實現(xiàn)非常高的分辨率，但在觀察網(wǎng)絡(luò)時用途有限，因為只能同時監(jiān)測少數(shù)細胞。此外，它們的侵入性可能會損害觀察中的現(xiàn)象。使用成像方法時不存在這些缺點。
有不同的方法可以通過不同的設(shè)置實現(xiàn)快速成像。共聚焦顯微鏡可以實現(xiàn)相對較高的幀速率，共振掃描儀可以達到幾十赫茲，但代價是空間分辨率。旋轉(zhuǎn)圓盤共焦系統(tǒng)可以實現(xiàn)更高的幀速率，在幾百赫茲的水平上，同時也會犧牲一些空間分辨率，主要是在 Z 軸上。
當需要較大時間分辨率時，就要選用寬場顯微鏡。靈敏度是高速顯微鏡相機最重要的特性，因為高靈敏度相機將能夠在困難條件下以較大幀的速率運行，同時仍能提供令人滿意的結(jié)果。高速相機的核心是傳感器， CMOS類型的傳感器可以獲得較大的靈敏度。
總而言之，活細胞成像具有廣泛的應(yīng)用，但也向研究人員提出了一組特殊的要求，這些要求在對固定細胞進行成像時是不存在的。
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