MEHP刺激以HIF-1α依賴的方式導(dǎo)致睪丸Leydig和Sertoli細(xì)胞的鐵死亡

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露會(huì)危害男性健康生殖功能。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物普遍存在于殺蟲劑和除草劑中，同時(shí)也可以通過食品包裝材料泄露于環(huán)境之中。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可在人體組織和血液中積累，并達(dá)到穩(wěn)定濃度；有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可模擬內(nèi)分泌激素的作用，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)激素分泌、合成障礙。鄰苯二甲酸二辛酯（DEHP）是一種廣泛運(yùn)用的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，已被證明會(huì)導(dǎo)致男性生殖功能障礙。當(dāng)下流行病學(xué)研究表明，DEHP暴露可引起男性精子質(zhì)量下降。孕期DEHP暴露可誘發(fā)子代患隱睪和尿道下裂。但DEHP刺激引起睪丸細(xì)胞功能障礙的機(jī)制尚未完全探明。
             
2021年12月，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科吳盛德課題組在Journal of Hazardous Materials發(fā)表了題為“Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes”的論文。論文第一作者為吳雨昊博士研究生。

                         
一、研究思路
01 體內(nèi)外驗(yàn)證DEHP刺激可導(dǎo)致睪丸損傷。
02 組學(xué)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出HIF-1α等信號(hào)通路出現(xiàn)異常。
03 探索HIF-1α信號(hào)通路的作用機(jī)制。
04 體外敲除HIF-1α進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α的作用。
               
二、結(jié)果
⭐ 體內(nèi)驗(yàn)證DEHP刺激可導(dǎo)致睪丸損傷
小鼠服用DEHP后，作者通過HE染色發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞脫落、細(xì)精管層數(shù)減少的現(xiàn)象，證明了DEHP可導(dǎo)致睪丸損傷。利用RNA-Seq，檢測(cè)服用DEHP的實(shí)驗(yàn)組和未服用DEHP的對(duì)照組。經(jīng)過GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因與氧化應(yīng)激和鐵代謝相關(guān)。同時(shí)KEGG分析篩選到與鐵離子代謝相關(guān)的ferroptosis途徑和谷胱甘肽代謝途徑。通過進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)HIF-1信號(hào)通路也受到了影響。接下來，作者開展了一系列實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均與RNA-seq的分析吻合。至此，作者已經(jīng)明確：在DEHP處理后，體內(nèi)亞鐵離子的濃度上升、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)、鐵離子代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)發(fā)生改變和HIF-1α表達(dá)增加，最終導(dǎo)致睪丸損傷。
                
⭐ 體外驗(yàn)證MEHP刺激可加速細(xì)胞死亡
作者在體內(nèi)驗(yàn)證了DEHP與睪丸損傷有相關(guān)性后，接著在體外進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與體內(nèi)的一致。MEHP是DEHP的主要生物代謝物，能替代DEHP用于體外實(shí)驗(yàn)。作者使用MEHP作為DEHP的替代物，處理TM3間質(zhì)細(xì)胞系（TM3 Leydig cell line）TM4支持細(xì)胞系（TM4 Sertoli cell line），發(fā)現(xiàn)能加速兩種細(xì)胞系的死亡。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)思路相似，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行RNA-Seq，通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因與氧化應(yīng)激和鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)。KEGG 分析也發(fā)現(xiàn)ferroptosis途徑、谷胱甘肽代謝途徑和HIF-1 信號(hào)通路受到影響。并且RNA-seq的分析結(jié)果也得到了實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。所以，作者體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在MEHP刺激后睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞后的ROS顯著增加、包括Hmox1等鐵離子代謝相關(guān)的基因表達(dá)模式發(fā)生改變、亞鐵例子的濃度上升和線粒體形態(tài)異常。
                  
⭐ HIF-1α 通過調(diào)控HO-1的表達(dá)影響亞鐵濃度
接著，作者開展機(jī)制探討。通過分析HIF-1信號(hào)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)編碼 PHD 的 Egln1 、 Egln3 在 MEHP刺激后下調(diào)。而PHD 復(fù)合物通常會(huì)降解 HIF-1α，并且通過 RT-qPCR 和WB檢測(cè)也驗(yàn)證 Egln1、Egln2 和 Egln3 與HIF-1α 和 HIF-1β的表達(dá)模式相反。接著通過分離了 Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白，發(fā)現(xiàn)MEHP 的刺激會(huì)影響 HIF-1α 穩(wěn)定性和積累，發(fā)現(xiàn)ME，導(dǎo)致 HIF-1α 從細(xì)胞質(zhì)易位進(jìn)入細(xì)胞核。接著通過 ChIP-qPCR 分析，發(fā)現(xiàn) HIF-1α 可以與 Hmox1 的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控HO-1（由 Hmox1 編碼）的表達(dá)。最終由于HO-1的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致亞鐵濃度上升。
                         
⭐ 體外敲除HIF-1α進(jìn)一步驗(yàn)證HIF-1α的作用
通過上述的一系列實(shí)驗(yàn)，作者篩選到與睪丸細(xì)胞損傷相關(guān)的基因：HIF-1α，并且初步發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機(jī)制。為了進(jìn)一步確認(rèn)這一結(jié)果，作者構(gòu)建了 HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞系（HIF-1α基因敲除的 Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞系，由賽業(yè)生物提供），用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。通過Sanger測(cè)序和Western blotting檢測(cè)，確認(rèn)了敲除細(xì)胞系中的HIF-1α被成功敲除。在 與野生型細(xì)胞相比，HIF-1α-KO的細(xì)胞系在MEHP刺激下細(xì)胞活力受損的程度有明顯改善。同時(shí)，脂質(zhì)過氧化（圖1b，I）和亞鐵超載（圖1c，J）也受到抑制。分別使用qPCR和Western印跡法評(píng)估Hmox1和HO-1水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲除Hif-1α能逆轉(zhuǎn)MEHP刺激下的Hmox1（圖1d，K）和HO-1（圖1g，N）表達(dá)水平上調(diào)。此外，MEHP刺激后ROS爆發(fā)（圖1E，L）和細(xì)胞死亡（圖1F，M）程度也在敲除HIF-1α后減弱。Western印跡顯示敲除HIF-1α恢復(fù)了ACSL4、FTH1和SLC7A11的表達(dá)，以及抑制GPX4的表達(dá)（圖1 G，N）�？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，MEHP刺激以HIF-1α依賴的方式導(dǎo)致睪丸 Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞的鐵死亡。

圖 1 HIF-1α基因敲除挽救了MEHP誘導(dǎo)的鐵死亡

                            
三、總結(jié)
作者通過MEHP刺激后的表型分析、RNA-Seq分析、ChIP-qPCR 分析等發(fā)現(xiàn)與睪丸細(xì)胞功能障礙相關(guān)的調(diào)控基因：HIF-1α。并初步發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機(jī)制：MEHP（體內(nèi)DEHP的主要生物代謝物）可抑制PHDs，影響HIF-1α積累和穩(wěn)定，導(dǎo)致HIF-1α易位到細(xì)胞核，并誘導(dǎo) Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞中HIF-1/Hmox1結(jié)合，使HO-1的表達(dá)上調(diào)。HO-1的過表達(dá)導(dǎo)致亞鐵超載，ROS積累，最終導(dǎo)致鐵死亡，損傷Leydig 和 Sertoli 細(xì)胞的活性。這一結(jié)果，進(jìn)一步在HIF-1α基因敲除的細(xì)胞系得到驗(yàn)證。
                            
四、參考文獻(xiàn)：
Wu Y, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. 2021, 127807. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.127807​