甲基化抑制劑是表觀遺傳學的載體
表觀遺傳學被定義為“不依賴于 DNA 序列的變化而是由于染色體改變所產生的穩(wěn)定可遺傳的表型”。DNA 甲基化，組蛋白結構的改變以及 microRNA 對基因的調控等都是表觀遺傳信息的重要載體。其中 DNA 甲基化作為重要的表觀遺傳修飾之一，對基因組穩(wěn)定性，轉錄和發(fā)育產生深遠影響。
甲基化到底是什么？
胞嘧啶第五碳的甲基化 (5- 甲基胞嘧啶：5mC) 是最早在真核生物中被挖掘出的甲基化類型，它也是今天我們要介紹給大家的重點。早在幾十年前，就有體內外研究表明，它與轉錄抑制有關。哺乳動物中，5mC 往往存在于 DNA 雙螺旋中的鳥嘌呤 (G) 的上游，即所謂的 CpG 位點。除了 5mC，其他的甲基化類型有：4- 甲基胞嘧啶 (4mC)，5- 甲基胞嘧啶 (5mC) 和 6- 甲基腺嘌呤 (6mA)。
DNA 甲基化具有多種功能：與轉座子和基因的抑制有關，但也與活躍轉錄的基因體 (gene body) 有關，在某些情況下還與基因激活本身有關。
DNA 是如何出現表觀遺傳修飾或標記呢？下面以哺乳動物中 5mC 為例，揭開 DNA 甲基化修飾的神秘面紗！
圖 1. DNA 復制過程中 CG 配對
Tip 1: CpG 是胞嘧啶 “C” 和鳥嘌呤 “G” 的縮寫，由磷酸酯 “p” 連接。在哺乳動物中，胞嘧啶甲基化主要發(fā)生在 CpG 二核苷酸中�？赏ㄟ^對二核苷酸序列 5'CpG3' 中胞嘧啶堿基的甲基化共價修飾脊椎動物的 DNA。
DNA 甲基化分為三個階段：甲基化的建立 (從頭開始 DNA 甲基化)，甲基化的維持和脫甲基。甲基化從寫入到擦除，牽涉著 DNMT 與 TET 兩大蛋白家族的“愛恨情仇”。
圖 2. 5mC 甲基化
DNMTs 家族蛋白又可細分為從頭甲基轉移酶 (DNMT3A, DNMT3B 和 DNMT3L) 和維持甲基轉移酶 (DNMT1) 兩大派別，在甲基化中發(fā)揮不同的作用。從頭甲基化：(De novo of DNA methylation )
DNA 甲基化通過稱為 DNMT3A 和 DNMT3B “從頭甲基化酶”在胚胎發(fā)育過程中建立。DNMT3A 和 DNMT3B 是對未甲基化的 DNA 具有活性的從頭甲基轉移酶，他們就像是甲基化歷程的“創(chuàng)業(yè)者”，不偏好半甲基化的 CpG 位點，“從頭”甲基化先前未被甲基化的 DNA。
DNMT3 家族還存在一個成員：DNMT3L。與 DNMT3A/3B 相比，缺乏甲基基序和催化結構域，但可以與 DNMT3A/3B 結合，刺激 DNMT3A/3B 的酶活性，在甲基化進程中推波助瀾。
維持甲基化：（Maintenance of DNA methylation）
維持甲基化，就是雙鏈 DNA 的一條鏈已經發(fā)生甲基化，已經發(fā)生甲基化的鏈想將這種甲基化狀態(tài)“薪火相傳”（通過半保留復制）。為完成這一步驟，“維持甲基轉移酶” (DNMT1) 上線，DNMT1 更像是個獵頭，只認識甲基化 CpG，沒有甲基化的 CpGs 不會成為維持甲基轉移酶 DMNT1 的底物。在這個進程中，DNMT1 相互作用蛋白 UHRF1 (多結構域蛋白 E3 泛素蛋白連接酶) 至關重要，因為 UHRF1 的 SET 和 RING 相關 (SRA) 域對半甲基化的 DNA 具有強烈的偏好，能幫助 DNMT1 在復制叉處靶向底物 CpG 二核苷酸。
Tip 3：為確保親代模式在子代鏈上的復制，一種“維持甲基轉移酶” DNMT1，只會將甲基化 CpGs 堿基與甲基化的親代 CpG 配對，非甲基化 CpGs 不會成為其底物。這種簡單機制的結果是，DNA 甲基化模式會像 DNA 自身的堿基序列一樣被半復制。
除 DNA 甲基化——擦除蛋白 -Tet 啟動的 DNA 脫甲基途徑
DNA 脫甲基涉及被動和主動脫甲基的兩個過程來實現：5- 甲基胞嘧啶 (5mC) 作為 DNA 修飾的主要形式。結構上，甲基通過牢靠的碳-碳雙鍵與胞嘧啶堿基的 5 位連接，為直接去除甲基加了一層保險。機制上，前文提到的 DNMT3 以及官能伙伴 UHRF1 一起協助維持這種狀態(tài)。盡管如此，5mC 依然有自己的辦法逃脫層層枷鎖。
被動 DNA 脫甲基化:
功能性的 DNA 甲基化維持機制缺乏，使得 DNA 復制過程中 5mC 的逐步‘稀釋’ (passive solution)，這個過程通常被稱為被動 DNA 脫甲基化 (參照 Fig 2)。該事件主要發(fā)生在分裂細胞中，DNMT1 的抑制或功能障礙會使新摻入的胞嘧啶保持未甲基化，潤物細無聲地降低了每個細胞分裂后的總體甲基化水平。主動 DNA 脫甲基化:
敲黑板嘍，該脫甲基化的過程，也稱為活性去甲基化。在這個過程中 TET 蛋白家族起到了舉足輕重的作用 (參照 Fig 3)。
圖 4. Tet 啟動的 DNA 脫甲基 (氧化位點已圈出)在主動脫甲基化的過程中，5mC 通過 TET 蛋白，不斷被氧化，一步步去除“甲基化帽子”。
這個過程中。TET 蛋白像個探測器一樣，可以沿著 DNA “拉鏈”從一個點滑動到另一個 CpG 位點，最神奇的是，TET 會優(yōu)先識別并且氧化同一 DNA 分子上的其他 CpG 位點。
TET 蛋白可以介導 5mC 迭代氧化為 5- 羥甲基胞嘧啶 (5hmC)，5- 甲酰基胞嘧啶 (5fC) 和 5- 羧胞嘧啶 (5caC)。氧化的 5mC 衍生物不能用作 DNMT1 的底物，在復制的過程中被動脫甲基作用而丟失，胸腺嘧啶DNA糖基化酶 (TDG) 介導的 5fC 和 5caC 切除的復制依賴稀釋，再加上堿基切除修復 (BER)，導致去甲基化，這個過程被定義為主動修飾-主動去除 (AM-AR)。此時的 5fC 和 5caC，就像是無業(yè)游民，TDG 能識別這種不正常的堿基并切除它們，隨后，AP 位點形成 (無嘌呤或者無嘧啶位點)，開始堿基切除修復。另外，也可以通復制依賴 5hmC，5fC 或 5caC 的方式稀釋 DNA 甲基化，即主動-被動去除 (AM-PD)。
Tip 4: TDG ：能夠識別不正常的堿基。如胞嘧啶 5mC 在脫氨基之后會直接形成尿嘧啶 5hmc，對于這些不正常的尿嘧啶，就可以被 TDG 切除掉,形成無嘌呤或者無嘧啶的位點。Base-excision repair：AP 位點形成，AP 核酸內切酶在 AP 位點將 DNA 鏈切開，然后核酸外切酶 1 將包括 AP 位點在內的 DNA 鏈切除。這種單個堿基的修復叫做堿基切除修復。
如果將甲基化的 DNA 比作是一匹千里馬的話，那么三個識別的蛋白家族 (MBD 蛋白質，UHRF 蛋白質和鋅指蛋白) 算得上是識別它的伯樂了。
MBD 家族由 MeCP2 和 MBD1-6 組成，共享一個保守的 MBD 域，這也與甲基化 DNA 結合所必需的。MeCP2，MBD1 和 MBD2 還包含一個 TRD 域，可幫助他們募集染色質重塑核心加壓因子 (chromatin remodeling corepressors)，從而引起轉錄沉默。如 MeCP2 的 TRD 結構通過募集包含 Sin3A 共阻遏物和組蛋白脫乙�；� (HDAC1 和 HDAC2) 的染色質重塑復合體來參與介導基因沉默。
UHRF 蛋白 (如 UHRF1 和 UHRF2 )，前面在維持甲基化中已經提過它的作用了。鋅指蛋白 (Kaiso，ZBTB4 和 ZBTB38) 則是通過鋅指結構域與甲基化 DNA 結合。其中 Kaiso 被認為是轉錄阻遏物，可以與活躍表達基因的未甲基化區(qū)域結合。DNA 甲基化與組蛋白修飾
DNA 甲基化和組蛋白修飾的關系千絲萬縷。簡而言之，DNA 甲基化有助于引導組蛋白修飾，組蛋白修飾又會指導 DNA 甲基化。例如 DNMT3A 的 PWWP 域會與 H3K36me3 相互作用，增強 DNMT3A 的活性。同樣，組蛋白修飾在 DNA 甲基化機制中也起著重要作用。拿 DNMT1 啟動子過程中的甲基化來說，H3K4me3 可抑制DNMT3 酶。而在沒有 H3K4 甲基化的情況下，抑制會得以解除，從而使 DNA 甲基化。
H3K4me3 標記了活躍的啟動子，阻止了 DNMT3A 和 DNMT3B (以及DNMT3L) 的 ADD 域的染色質結合，從而使 ADD 與甲基轉移酶 (MTase) 結構域結合并自動抑制 DNMT3 酶。在沒有 H3K4 甲基化的情況下，ADD 域與 H3K4 結合，并且自動抑制得以解除，從而 MTase 域可以使 DNA 甲基化。
Tip 5：H3K4me3 標記了活躍的啟動子，阻止了 DNMT3A 和 DNMT3B (以及DNMT3L) 的ADD域的染色質結合，從而使ADD 與甲基轉移酶 (MTase)結構域結合并自動抑制 DNMT3 酶。在沒有H3K4甲基化的情況下，ADD 域與 H3K4 結合，并且自動抑制得以解除，從而 MTase 域可以使 DNA 甲基化。
在高等動物中，癌細胞中的 DNA 甲基化模式明顯“扭曲”。大約 70％ 的基因擁有與啟動子相關的 CpG 島 (CG 堿基頻率高的區(qū)域)，而維持未甲基化的啟動子 CpG 島對提高轉錄潛能有積極作用，并與活性的組蛋白修飾如組蛋白 H3 和 H4 的乙�；� H3K4 的甲基化有關。
相反，癌細胞明顯表現出 CpG 島的密集高甲基化，包括基因間區(qū)和重復元件在內的大量染色質的低甲基化。密集甲基化的 CpG 島能夠讓原本松散的染色質緊縮在一起，抑制與“抑制性修飾” (H3K9me2/3，H3K27me3 和/或 H4K20me3) 相關的基因表達,可見 DNA 甲基化顯著著影響癌細胞的基因組格局。
Tip 6: DNA 被包裹在組蛋白的八聚體中，形成核小體，即染色質的最小單位。
正常情況下轉錄時是開放松散的染色質結構：組蛋白 H3 和 H4 的高度乙酰化，組氨酸 H3 在賴氨酸 4 (H3K4me2/2/3) 處的二甲基和三甲基化 (Fig 5A)。然而，當轉錄由于被甲基化受阻時，受阻區(qū)域染色質結構就會變得緊縮在一起，H3/H4 乙�；� H3K4 甲基化不顯示，取而代之的是富含 H3K9 (H3K9me2/3)，H3K27的三甲基化 (H3K27me3) 和 H4K20 的三甲基化 (H4K20me3)(Fig 5)。
DNA 甲基化抑制劑
DNA 甲基化抑制劑一般分為核苷類似物和非核苷類似物化合物。核苷類似物如 Decitabine，5-Azacytidine，Zebularine，它們可摻入 DNA 中，摻入后，它們充當 DNMT 酶的自殺底物。非核苷化合物可以抑制 DNA 甲基轉移酶活性，如 RG108，DC-05，它們直接阻斷 DNA 甲基轉移酶的活性。Decitabine (NSC 127716)
Decitabine，地西他濱，FDA 批準的 DNA 甲基轉移酶 (DNMTs) 抑制劑。通常用于治療骨髓增生異常綜合征 (MDS) 和急性髓性白血病 (AML)。Decitabine 具有雙重的劑量依賴性作用機制。高劑量時，Decitabine 通過摻入 DNA 代替胞嘧啶后，可將 DNA 甲基轉移酶共價捕獲到 DNA 中，從而誘導細胞毒性作用。在較低劑量下其抗腫瘤效果可能是由于它能夠抑制 DNA 甲基化和重新激活腫瘤抑制基因。
5-Azacytidine (Azacitidine)
5-Azacytidine，阿扎胞苷，DNA 和 RNA 核苷胞苷類似物，也是FDA 批準的 DNA 甲基轉移酶 (DNMTs) 抑制劑，5-Azacytidine 必須與 DNA 結合以共價捕獲 DNA 甲基轉移酶。5-Azacytidine 也可以摻入到 RNA 中。
RG108 (N-Phthalyl-L-tryptophan)
RG108，非核苷類似物，是一種靶向人 DNA 甲基轉移酶 (DNMTs) 的抑制劑，IC50 值為 115 nM。RG108 結合并阻斷 DNMTs 的活性位點。RG108 缺少與 Decitabine 相關的高水平的細胞毒性。RG108 可在不影響著絲粒衛(wèi)星序列甲基化狀態(tài)的情況下，引起腫瘤抑制基因的去甲基化和再激活。
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