如何學習從細胞狀態(tài)判斷與避免污染
一、為什么要了解細胞形態(tài)
定期檢查培養(yǎng)細胞的形態(tài)（即形狀和外觀）對于取得細胞培養(yǎng)實驗成功至關重要。每次用眼睛和顯微鏡檢查細胞，除了確認細胞的健康狀況，我們還可以及早發(fā)現(xiàn)任何污染的跡象，避免污染擴散至實驗室其他細胞。
二、細胞形態(tài)變化的跡象
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細胞核旁顆粒的堆積
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細胞質中有空泡
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細胞團縮并從平板上脫離
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外形變化
三、細胞形態(tài)變化原因
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培養(yǎng)基改變
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細胞污染
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細胞老化
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有毒物質
四、哺乳動物細胞形態(tài)
大多數(shù)培養(yǎng)的哺乳動物細胞根據其形態(tài)可分為四大類。
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成纖維細胞（或成纖維細胞樣）：細胞是雙極或多極的，狹長型，貼壁細胞；
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上皮細胞呈多角形，尺寸更為規(guī)則，貼附在基質上呈散斑片狀生長；
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淋巴細胞，呈球形，通常懸浮生長，不貼附在基質表面；
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神經元細胞體（貼壁細胞）。
神經元有多種形狀和大小，可以粗略地劃分為兩個基本形態(tài)類別。I型具有很長的軸突，可長距離傳遞信號，II型則沒有軸突。典型的神經元會從胞體部發(fā)出具有許多分支的細胞伸展結構，因此被稱為樹突樹。神經元可以是單極或假單極細胞，即：樹突和軸突發(fā)自同一突起，可以是雙極細胞，即：軸突和單個樹突發(fā)自胞體（有核細胞的中心部分）上相對的兩端，也可以是多極細胞，即：細胞具有兩個以上的樹突。
五、細胞污染
1. 細菌污染
常見的細菌污染有枯草桿菌（Bacillus Subtilis）、大腸桿菌（Escherichia Coli）、假單胞菌（Pseudomonas）、白色葡萄球菌（Staphylococcus Albus）等，其中革蘭氏陽性菌較為多見。
圖片來源：Bing
細菌污染會導致培養(yǎng)基1~2d出現(xiàn)黃色或白色渾濁、顏色改變以及pH值急劇變化，受污染的貼壁細胞在幾天內會逐漸脫壁死亡；有些狀況下培養(yǎng)基顏色改變不明顯但細胞形態(tài)會變異（出現(xiàn)多角，多核）；顯微鏡觀察培養(yǎng)液中有大量圓球形顆粒物漂浮，呈細沙狀。
主要來源：
操作不當或器材消毒不嚴；細胞培養(yǎng)試劑污染細菌未被檢測出來。
解決辦法：
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2. 真菌污染
常見的真菌污染為煙曲霉，黑曲霉，毛霉菌，孢子霉，白色念珠菌，酵母菌等。
圖片來源：Bing
真菌污染后短期內不會出現(xiàn)培養(yǎng)液的渾濁，培養(yǎng)基中會漂浮白色、淺黃色或黑色的小點，4d左右可以在高倍鏡下觀察到絲狀，管狀或者串珠狀的菌絲。有些真菌開始很像死細胞碎片，但是與之不同的是，它有很多很多的小塊，很清楚，像珊瑚狀，不像死細胞碎片分不清。酵母菌污染，顯微鏡下常見成串的珠狀物，形態(tài)呈卵形，大約比細胞小5~10倍。當其進行出芽生殖時，會聚集成連體結構。
圖片來源：Bing
主要來源：
實驗人員（實驗服），并且具有季節(jié)性，像長蘑菇的季節(jié)很容易感染這種菌類。
解決辦法：
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3. 支原體污染
支原體是一種大小介于細菌和病毒之間（直徑0.15 μm~0.2 μm）并獨立生活的微生物，所以能透過一般的細胞培養(yǎng)過濾方法，0.22 μm的過濾膜。支原體無細胞壁，形態(tài)呈高度多形性�？蔀閳A形、絲狀或梨形。支原體形態(tài)多變，在光學顯微鏡下不易看清內部結構。
圖片來源：Bing
細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達到63%。支原體早期污染，培養(yǎng)液也不渾濁。后期污染會出現(xiàn)培養(yǎng)基變色、細胞生長受抑、細胞成團、鏡下有小顆粒甚至死亡。研究表明，支原體能耗盡營養(yǎng)物，促進代謝積累，導致pH改變，對細胞造成多種影響，包括生長狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細胞存活等多方面的改變，繼而干擾實驗結果，或造成無法解釋的差異。
支原體污染的來源：
工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細胞造成交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。
解決辦法：
逍鵬生物可提供：支原體檢測/處理/預防全套解決方案。
1. 即用型細胞培養(yǎng)中支原體檢測PCR試劑盒
2. 支原體處理試劑
3. 支原體預防噴霧
支原體檢測/處理/預防全套解決方案：
4. 病毒污染：
病毒感染可能來自宿主動物細胞或病人，病毒感染及傳播具有細胞專一性，在細胞培養(yǎng)污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀察到細胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴重時會在單層細胞上觀察到局部破損空斑。
污染來源：
可能來源于血清，胰酶及其他動物源試劑。如BSA，HSA等。
解決辦法：
逍鵬生物提供的解決方案：選用輻照血清以殺滅病毒。
5. 黑膠蟲污染
目前科學界對黑膠蟲并無定論，認為是不明沉淀現(xiàn)象或多種未知生物污染現(xiàn)象的通稱。Dr.Cell 目前檢測的黑膠蟲樣本，62%為細菌，38%為支原體。
在顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有小黑點狀顆粒（卵圓狀、球狀、桿狀等），并做活躍的布朗運動或原地顫動，即可大致判斷為黑膠蟲污染。黑膠蟲比細胞體積小很多，主要分布在細胞間隙。黑膠蟲污染前期細胞無明顯變化，培養(yǎng)液中有少許做布朗運動的小黑點，污染后期小黑點會迅速增殖導致細胞出現(xiàn)裂解死亡。細胞勤換液可以稍微緩解黑膠蟲增殖速度，但無法擺脫污染。
污染主要來源：
因為目前科學界對于黑膠蟲并無準確定論，因此主要來源也無法進行斷論。根據Dr.Cell檢測的黑膠蟲樣本可以看出，黑膠蟲的來源是多樣性的，試劑，耗材，人為等都有可能。
解決辦法：
逍鵬生物可提供以下解決方案：
使用三抗（貨號：03-032-1B）結合支原體處理試劑（貨號：03-036和03-037或03-038）有效清除實驗室黑膠蟲污染。
6. 細胞交叉污染和錯誤辨識
做實驗遭遇細胞系污染的心情無異于得知追了很久的女神（男神）已經有了另一半。更糟糕的是，這兩件事情發(fā)生的概率都比想象的高。
HeLa 細胞，堪稱細胞界的“隔壁老王”。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。據統(tǒng)計約30%細胞系被交叉污染或錯誤辨識。Science雜志2014年12月發(fā)表了一篇題為“Cell Biology. Fixing problems with cell lines”的專題文章闡述細胞交叉污染和錯誤辨識，2個月后Science一篇題為“Line of attack”文章描述在學術界中培養(yǎng)的細胞發(fā)生交叉污染或被錯誤辨識的嚴重性。2015年4月Nature通知：Nature旗下雜志將從5月開始要求作者鑒定論文中所用細胞系。
細胞株的交叉污染，常因不經意的實驗疏忽（不同細胞株分盤時，共享一瓶培養(yǎng)基；槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細胞株之間的混合污染；實驗操作人員錄入錯誤細胞株名稱；傳代時的培養(yǎng)皿；冷凍細胞時的凍存管）而發(fā)生，繼而造成后續(xù)數(shù)據搜集錯誤。
主要原因：
標記錯誤和細胞間的交叉污染。
解決辦法：
Dr.Cell可提供：（點擊名稱鏈接可進入詳情頁）
1. 人源細胞系STR鑒定（STR Authentication）
2. 細胞物種鑒定（Species Identification）-15種常見種屬的物種鑒定
掌握好這些細胞污染的鑒別，找到導致自己細胞狀態(tài)不好的“元兇”，相信您培養(yǎng)的細胞一定越來越好！
REFERENCES
【1】Morozkin ES, Sil Nikov VN, Rykova EY, Vlassov VV, LaktionovPP. Extracellular DNA in culture of primary and transformed cells, infected and not infected with mycoplasma. Bull Exp BiolMed 2009; 147(1): 63-5.
【2】Kenny GE. CHAPTER 5-contamination of mammalian cells in culture by mycoplasmata. Contamination in Tissue Culture 1973;49(10): 107-29.
【3】 Rottem S, Barile MF. Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol 1993; 11(4): 143-51.
【4】陳琳, 陳鯉群. 細胞污染及檢測鑒定[J]. 中國細胞生物學學報, 2017(04):496-503.
【5】http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0170384#pone-0170384-t001
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