阿爾茨海默癥行為學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)-水迷宮的使用與操作

 

在介紹實(shí)驗(yàn)流程之前，我們需要了解水迷宮實(shí)驗(yàn)的兩大要素，驅(qū)動(dòng)力和考核內(nèi)容。水迷宮的驅(qū)動(dòng)力是小鼠本能對(duì)水環(huán)境的厭惡，這就驅(qū)使小鼠想要盡快逃離這個(gè)環(huán)境，其中略低于水面的平臺(tái)就可以讓小鼠基本達(dá)成逃離水環(huán)境的目標(biāo)。因此小鼠有動(dòng)力盡快找到這個(gè)平臺(tái)；而考核內(nèi)容則是分析小鼠是不是能夠盡快學(xué)會(huì)用周圍的提示物（Cues）為線索找到水下平臺(tái)。絕大部分水迷宮實(shí)驗(yàn)主要包括（但不限于）以下三個(gè)部分：

（1）平臺(tái)可見(jiàn)期實(shí)驗(yàn)（2 days）；

（2）平臺(tái)隱藏期訓(xùn)練（5 days）；

（3）無(wú)平臺(tái)期檢測(cè)（1 day）。

圖1. 標(biāo)準(zhǔn)水迷宮實(shí)驗(yàn)日期表（不含適應(yīng)環(huán)境期）

 

下面我們就來(lái)詳細(xì)介紹以下這種標(biāo)準(zhǔn)水迷宮實(shí)驗(yàn)的流程:

 

小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的適應(yīng)

有條件的話小鼠應(yīng)該在正式實(shí)驗(yàn)前1周移入水迷宮實(shí)驗(yàn)房間進(jìn)行飼養(yǎng)。如果沒(méi)有這樣的條件，也應(yīng)該盡量將小鼠至少連續(xù)三天每天移入水迷宮房間2-4小時(shí)，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員也應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)前與小鼠有連續(xù)5天以上，每天2min的熟悉過(guò)程。

PS：相對(duì)新物體識(shí)別和自主交替實(shí)驗(yàn)，逃生欲望算是一個(gè)比較強(qiáng)的動(dòng)力，所以水迷宮中適應(yīng)環(huán)境并沒(méi)有剛才說(shuō)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)敲搓P(guān)鍵，但為了增加實(shí)驗(yàn)的可靠性，讓小鼠熟悉飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員仍然是必不可少的。

 

平臺(tái)可見(jiàn)期實(shí)驗(yàn)（“體檢”期）

（1）按照前文所述的方法搭建水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)施，個(gè)人傾向于Cue放在水池內(nèi)部，因?yàn)樗�池�?nèi)部的Cue更容易被小鼠看到。

（2）將水池分為四個(gè)象限，分別用N，S，W，E命名，此外再設(shè)定8個(gè)放小鼠下水的方位，從9點(diǎn)鐘的1號(hào)位置開(kāi)始逆時(shí)針到10點(diǎn)鐘位置的8號(hào)位，當(dāng)然這種位置的序號(hào)是可以自定義的。

（3）每天每只小鼠進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，前兩次和后兩次平臺(tái)分別放在兩個(gè)不同的位置，如圖2所示，放小鼠的位置在平臺(tái)所在象限對(duì)面象限的兩側(cè)位置，例如平臺(tái)如果在N位置，放置小鼠的位置就在2和4。

（4）放置小鼠時(shí)小鼠面朝水池壁，下水輕柔，不要讓小鼠嗆水（這個(gè)步驟在無(wú)論是在平臺(tái)隱藏期還是Probe時(shí)期都是一樣的）。

（5）小鼠在水中自由探索1分鐘，超過(guò)1分鐘未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)并讓小鼠在平臺(tái)上停留15s（這個(gè)步驟在平臺(tái)隱藏期是一樣的）。

（6）將小鼠擦干，防止熱量損失過(guò)多，有條件的話擦干后的小鼠放在31-33度左右的鼠籠中進(jìn)行“烘烤”一分鐘左右再放入臨時(shí)籠中（不要放入長(zhǎng)期飼養(yǎng)用的籠子里）。

（7）清理水池表面的糞便（可以連續(xù)2-4只小鼠實(shí)驗(yàn)后清理，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中少量糞便影響不大）。

（8）每只小鼠兩次下水的時(shí)間間隔不少于20min（因?yàn)樯婕案鼡Q平臺(tái)方位，所以每次都將所有實(shí)驗(yàn)用的小鼠完成試驗(yàn)后再開(kāi)始下一輪比較好）。

（9）平臺(tái)可見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)有時(shí)1天以內(nèi)就可以檢測(cè)到小鼠運(yùn)動(dòng)和視力是否有明顯問(wèn)題，所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，有時(shí)也只需要一天時(shí)間。

圖2. 平臺(tái)可見(jiàn)期實(shí)驗(yàn)方案

 

平臺(tái)隱藏期實(shí)驗(yàn)（訓(xùn)練期）

（1）平臺(tái)高度低于水平面0.5cm-1cm左右，在所有隱藏平臺(tái)期內(nèi)的平臺(tái)位置固定，為了方便描述，我們將平臺(tái)的位置設(shè)定為E。

（2）將小鼠面朝水池壁輕輕放入水中。每天針對(duì)每只小鼠的四次實(shí)驗(yàn)，小鼠都是從2，3，8，7這幾個(gè)位置隨機(jī)放入（其實(shí)是偽隨機(jī)，每天四個(gè)位置都要用到，只是順序可以隨機(jī)），圖3中就是偽隨機(jī)的實(shí)驗(yàn)方案示意圖。

（3）其余步驟和平臺(tái)可見(jiàn)期的步驟（3）—（8）相同。

（4）記錄全部過(guò)程影像資料以便分析。

圖3. 平臺(tái)隱藏期實(shí)驗(yàn)方案

 

無(wú)平臺(tái)探索期實(shí)驗(yàn)（測(cè)試期）

平臺(tái)隱藏期實(shí)驗(yàn)完成后一段時(shí)間（具體時(shí)間間隔根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定），撤去平臺(tái)，將小鼠從1號(hào)位放入（平臺(tái)隱藏期一直沒(méi)有用到的離目標(biāo)平臺(tái)最遠(yuǎn)的位置），記錄小鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程以便后來(lái)分析。

圖4. 無(wú)平臺(tái)探索期實(shí)驗(yàn)方案

 

反轉(zhuǎn)記憶實(shí)驗(yàn)（Spatial Reversal）

這個(gè)階段并非必須，但是有些基因的改變或者藥物的處理并不會(huì)使小鼠在常規(guī)的水迷宮學(xué)習(xí)階段或者探索實(shí)驗(yàn)階段出現(xiàn)明顯的差異，而主要是影響小鼠記憶的靈活性和對(duì)固有認(rèn)知根據(jù)現(xiàn)實(shí)情況進(jìn)行調(diào)整的能力，反轉(zhuǎn)試驗(yàn)就是應(yīng)用在這種更為精細(xì)的學(xué)習(xí)記憶能力的差異研究之中，對(duì)基因的功能和藥效進(jìn)行細(xì)致的檢測(cè)。

 

可調(diào)整參數(shù)及注意事項(xiàng)

水迷宮動(dòng)物操作的四個(gè)階段中，可以調(diào)整的參數(shù)不少，而且這些參數(shù)的調(diào)整，很大程度上也影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面我們來(lái)看看每個(gè)階段可調(diào)整因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響吧。

 

首先是我們從宏觀上看，適應(yīng)期和平臺(tái)可見(jiàn)期的實(shí)驗(yàn)都不是必須的，更有甚者在論文中連無(wú)平臺(tái)探索期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也沒(méi)有展示。實(shí)際上，只有平臺(tái)隱藏期的實(shí)驗(yàn)也能夠?qū)π∈蟮膶W(xué)習(xí)記憶能力起到一定的檢測(cè)作用。但是個(gè)人非常不推薦這么做，首先這樣會(huì)少了很多對(duì)照實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，而且這些實(shí)驗(yàn)中獲得的運(yùn)動(dòng)能力和視力的對(duì)照數(shù)據(jù)本身也是非常有意義的；其次這樣文章中也會(huì)少了不少論據(jù)，而且大多數(shù)雜志是不接受這種極簡(jiǎn)版的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的。還有就是如果沒(méi)有Probe期實(shí)驗(yàn)，很難排除一些采用非空間記憶方式完成水迷宮任務(wù)的小鼠，比如有的小鼠會(huì)采取保持與水池邊緣一定距離繞圈的策略。

 

另外實(shí)驗(yàn)人員與小鼠熟悉的過(guò)程非常重要，而且小鼠本身就容易焦慮或者抑郁，如果沒(méi)有讓小鼠放下戒心，影響的就不止是小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力了。

 

另外就是可見(jiàn)平臺(tái)期前也可以進(jìn)行一次水池適應(yīng)實(shí)驗(yàn)（60分鐘），就是將小鼠放入水池中熱一下身，但不是必須的。

 

關(guān)于可見(jiàn)平臺(tái)期的試驗(yàn)，首先是這個(gè)實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間可以是1天或者1天以上，但是不宜過(guò)多；還有就是這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以放在實(shí)驗(yàn)的最開(kāi)始階段，也可以放在Probe實(shí)驗(yàn)之后，甚至在隱藏平臺(tái)期中也可以插入一天進(jìn)行。一般而言，如果動(dòng)物年齡比較大或者水迷宮前有傷害性操作（手術(shù)和藥物），需要將可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)放在隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)之前，提前確認(rèn)運(yùn)動(dòng)能力和視力，防止體弱小鼠在漫長(zhǎng)的隱藏平臺(tái)期實(shí)驗(yàn)中死亡。

 

平臺(tái)隱藏期是最重要的實(shí)驗(yàn)階段，并且一般而言，這個(gè)階段的實(shí)驗(yàn)耗時(shí)最長(zhǎng)（4-7天最為常見(jiàn)），如果發(fā)現(xiàn)小鼠已經(jīng)基本達(dá)到尋找平臺(tái)的時(shí)間極限之后就可以不用繼續(xù)了，這個(gè)極限的時(shí)間一般是小鼠尋找平臺(tái)的平均時(shí)間，接近15s左右。

 

此外，在基礎(chǔ)的水迷宮實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，還可以通過(guò)延長(zhǎng)Probe實(shí)驗(yàn)的次數(shù)，研究動(dòng)物對(duì)原有平臺(tái)位置記憶的消退時(shí)間。不過(guò)，對(duì)平臺(tái)位置記憶的消退時(shí)間有兩種解讀方式，如果對(duì)小鼠經(jīng)過(guò)多次Probe實(shí)驗(yàn)還“冥頑不靈”，花大量時(shí)間堅(jiān)守在原平臺(tái)所在象限進(jìn)行尋找，我們就一方面可以說(shuō)小鼠的記憶持續(xù)時(shí)間很久，另一方面也可以認(rèn)為小鼠的記憶可重塑性較弱。

 

如果我們?cè)赑robe實(shí)驗(yàn)之后，馬上開(kāi)始另一次隱藏平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)，而這次隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的平臺(tái)位置與第一次隱藏平臺(tái)時(shí)不同，那么在這個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)的就是小鼠的二次學(xué)習(xí)能力，又叫反向訓(xùn)練。你可以理解為將原有的過(guò)時(shí)的位置信息進(jìn)行修正，找到新的標(biāo)志物與平臺(tái)位置的聯(lián)系。這種方法一般用于對(duì)更輕微的神經(jīng)損傷進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)在第二次隱藏平臺(tái)的訓(xùn)練過(guò)程之后，還可以進(jìn)行Probe實(shí)驗(yàn)。

 

小結(jié)

相比于大多數(shù)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，水迷宮有如下優(yōu)點(diǎn)：

1. 驅(qū)動(dòng)力強(qiáng)，小鼠不喜歡水泡的狀態(tài)，希望盡快擺脫，因此小鼠會(huì)使出渾身解數(shù)逃離。

2. 其他實(shí)驗(yàn)中存在的氣味作為線索的因素基本消失，小鼠隨時(shí)排泄排便，極易在行為學(xué)設(shè)備中留下氣味。這些氣味會(huì)干擾下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)狀態(tài)并影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而這些都在大量水的稀釋下趨近于最低。

3. 訓(xùn)練階段和實(shí)驗(yàn)階段可以獲得大量小鼠的行為數(shù)據(jù)，如找到平臺(tái)的時(shí)間、路程、策略，小鼠不同階段速度和運(yùn)動(dòng)軌跡的比較等等，從而對(duì)小鼠的行為進(jìn)行更精確的分析。

4. 相對(duì)禁食對(duì)老年小鼠健康的影響，電擊造成年輕小鼠的精神創(chuàng)傷而言，傷害要小一些。

5. 非條件反射實(shí)驗(yàn)，省去了部分學(xué)習(xí)時(shí)間。

 

當(dāng)然水迷宮也不是毫無(wú)缺點(diǎn)，相比于新物體識(shí)別和巴恩斯迷宮，水迷宮對(duì)小鼠的刺激還是比較強(qiáng)的，年老或者疾病小鼠在實(shí)驗(yàn)中死去的情況并不罕見(jiàn)。

 

總而言之，水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)空間記憶和參考記憶的檢測(cè)是相當(dāng)靈敏且有效的，不過(guò)，其環(huán)境搭建要求比較嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要有嚴(yán)格的對(duì)照數(shù)據(jù)分析排除非學(xué)習(xí)記憶因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作員有很高的要求，除了需要詳細(xì)了解原理之外，實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)也是相當(dāng)重要的。

 

好了，關(guān)于水迷宮實(shí)驗(yàn)部分就介紹到這里，下一期我們將介紹水迷宮實(shí)驗(yàn)中所獲取主要數(shù)據(jù)的分析方法。

 

關(guān)于神經(jīng)退行性疾病，黃穎博士寫(xiě)了一系列的科普文章，感興趣的老師可以點(diǎn)擊文章頂部專輯進(jìn)行查看哦~此外，黃穎博士還進(jìn)行了兩期神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的直播課，錯(cuò)過(guò)的老師可以通過(guò)以下方式進(jìn)行回看：

1. 搜索【賽業(yè)生物】進(jìn)入賽業(yè)官網(wǎng)點(diǎn)擊【賽業(yè)大講堂】—【賽業(yè)公開(kāi)課】，即可觀看往期課程。

2. 關(guān)注“賽業(yè)生物訂閱號(hào)”，點(diǎn)擊菜單賽業(yè)課堂—公開(kāi)課，即可觀看往期課程。

3. 在B站搜索“賽業(yè)生物”，關(guān)注我們，即可觀看我們往期的課程。

 

參考文獻(xiàn)：

1. Erik D. Roberson. Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia[M]. Humana Press, 2011.

2. Vorhees C V, Williams MT. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. (2006) 1:848–58. doi: 10.1038/nprot.2006.116.