體液黃嘌呤氧化酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

體液黃嘌呤氧化酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

YIJI體液黃嘌呤氧化酶活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)黃嘌呤氧化酶和過(guò)氧化酶酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中生成的過(guò)氧化氫，與顯色染料作用后，產(chǎn)生醌亞胺產(chǎn)物所呈現(xiàn)的吸光峰值的變化，即采用比色法來(lái)測(cè)定體液樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物或人體體液樣品（血液、精液、腦脊液、尿液等）黃嘌呤氧化酶的活性檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase；XO；EC1.17.3.2），又稱為黃嘌呤氧化還原酶（xanthine oxidoreductase）是復(fù)合鉬酸黃素酶（molybdoflavoenzyme），是人體中嘌呤分解代謝過(guò)程中的終端酶，存在于所有生命體中。在哺乳動(dòng)物中，主要在肝臟和小腸高度表達(dá)。黃嘌呤氧化酶是一個(gè)單分子多元素構(gòu)成的大分子結(jié)構(gòu)體，分子量為270KD，含有2個(gè)黃素分子、2個(gè)鉬原子、8個(gè)鐵原子，參與呼吸鏈電子傳遞。黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤的羥基化作用，產(chǎn)生黃嘌呤（xanthine），進(jìn)而氧化為尿酸（uric acid）。此外，黃嘌呤氧化酶可以作為NADH氧化酶，產(chǎn)生超氧陰離子和過(guò)氧化氫，影響各種細(xì)胞分子成分，導(dǎo)致細(xì)胞退化和死亡，以及心血管疾病。肝病患者的肝組織中黃嘌呤氧化酶活性1000倍高于正常人水平。黃嘌呤氧化酶缺陷將引起黃嘌呤尿（xanthinuria），導(dǎo)致腎衰竭�；�于底物次黃嘌呤（hypoxanthine），在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）的催化下，生成過(guò)氧化氫，然后借助過(guò)氧化酶（peroxidase）的作用，與對(duì)羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）和氨基安替比林（4-aminoantipyrine）反應(yīng)，形成有色醌亞胺（quinoneimine），通過(guò)其吸收峰值的變化（510nm波長(zhǎng)），來(lái)定量分析黃嘌呤氧化酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI緩沖液（Reagent A） 毫升

YIJI底物液（Reagent B）      毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent C）      毫升

YIJI陰性液（Reagent D）   微升

產(chǎn)品說(shuō)明書    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；有效保證6月

用戶自備

抗凝管：用于血液采集的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

選擇一：血漿樣品

• 準(zhǔn)備好肝素或ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA抗凝管）
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇二：血清樣品

1． 準(zhǔn)備好不含抗凝劑的儲(chǔ)存管 

• 抽取1毫升血液，置于儲(chǔ)存管里
• 室溫下，靜置30分鐘，直至血液凝結(jié)
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分（注意：避免觸碰白色液體層）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

選擇三：尿液/腦脊液/唾液/精液樣品 

• 準(zhǔn)備好1.5毫升離心管
• 移取1毫升液體到離心管 
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管 
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻置于冰槽里備用或放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)510nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；YIJI底物液（Reagent B）避免光照；YIJI緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

• 樣品測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入50微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（15分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)板測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent A）到96孔板中
• 分別加入xx微升YIJI底物液（Reagent B）
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent C）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升YIJI陰性液（Reagent D）或待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和15分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測(cè)定15分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/50微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 黃嘌呤氧化酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾黃嘌呤至尿酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列氧化酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感