利用具有pH檢測控制和補料功能的新型搖床研究利福霉素SV種子培養(yǎng)過程

杜吉泉② 王軍峰 儲炬 王永紅 莊英萍 張嗣良③
（華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室 國家生化工程技術(shù)研究中心，上海 200237）

摘要： 種子培養(yǎng)過程中pH變化規(guī)律能夠反映菌體對不同營養(yǎng)物質(zhì)的利用情況及菌體生理特性的變化，可為移種時機的選擇提供線索。在實際生產(chǎn)過程中通過取樣來確定種子的生長狀況存在較多弊端，而通過數(shù)學模型對種子的生長進行預(yù)測有很大的優(yōu)勢。本文利用具有pH檢測控制與補料功能的新型搖床，得到了利福霉素SV種子的最適接種量范圍為6～8%（v/v）及最適移種時間為對數(shù)生長期末期（判斷標準為pH到達第二個低谷），并建立了預(yù)測菌體濃度的數(shù)學模型，檢驗證明此模型能夠較準確地預(yù)測利福霉素SV產(chǎn)生菌在對數(shù)生長期及移種時（對數(shù)生長期末期）的菌濃，并可用于預(yù)測在一定接種量下達到預(yù)定菌濃所需的培養(yǎng)時間。

關(guān)鍵詞： 具有pH檢測控制和補料的搖床；利福霉素SV； 培養(yǎng)過程優(yōu)化； 菌濃預(yù)測；數(shù)學模型

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A

Studies on Rifamycin SV Seed Cultivation with
pH-controlled fed-batch shaker①
Du Ji-quan②, Wang Jun-feng, Chu Ju, Wang Yong-hong, Zhuang Ying-ping, Zhang Si-liang③
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, National Engineering Research Center for Biotechnology (Shanghai), East China University of Science & Technology, Shanghai 200237)

ABSTRACT The variety of pH during rifamycin SV seed cultivation responses to the consumption of substrates and usually can indicate the physiological characteristics of Amycolatopsis mediterranei. The process of vegetative seed cultivation was investigated with pH-controlled fed-batch shaker (ab. pH-shaker). The optimized time window for seed transferring was the second valley of the pH profile and the optimized inoculum amount was 6~8% (v/v). Furthermore, a mathematical model for predicting the PMV of the vegetative seed process was developed, which was proved suitable for logarithmic phase of vegetative seed growth.
KEY WORDS pH-controlled fed-batch shaker; Rifamycin SV; Optimization of seed cultivation; PMV prediction; mathematical model

利福霉素（Rifamycin）是由地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）產(chǎn)生的一類安莎大環(huán)類抗生素，廣泛應(yīng)用于治療結(jié)核病、麻風病和與艾滋病有關(guān)的分枝桿菌感染[1]。其最主要活性組分SV和B是利福平、利福噴叮等利福霉素類藥物的直接前體[2,3]。目前我國利福霉素產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的絕大部分，但生產(chǎn)水平經(jīng)常出現(xiàn)波動，其中種子退化及種子質(zhì)量控制不穩(wěn)定是一個主要原因，因此種子質(zhì)量的穩(wěn)定控制意義重大。
菌絲濃度是反映種子質(zhì)量的一個關(guān)鍵指標，對它進行在線測量目前仍是一個難題。利用數(shù)學模型對種子培養(yǎng)過程的菌濃及生長狀況進行預(yù)測是快速估計菌體濃度的有效方法之一，黃明志等[4]曾經(jīng)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對發(fā)酵過程中細胞濃度進行了在線估計，并取得較好效果。

具有pH檢測控制和補料功能的新型搖床（以下簡稱pH搖床），相當于一個多罐并聯(lián)操作的簡易型生物反應(yīng)器，能夠?qū)崿F(xiàn)菌株大量快速篩選、種子擴大培養(yǎng)、生理生化特性研究、培養(yǎng)基優(yōu)化、補料工藝優(yōu)化等多種目的。Jutta Altenbach-Rehm等人[5,6]曾用類似裝置對重組E.coli表達GDP-manPP的發(fā)酵過程進行了研究，結(jié)果利用優(yōu)化后的誘導劑IPTG的添加策略使產(chǎn)物產(chǎn)量提高了一倍。本文利用pH搖床研究了利福霉素SV種子培養(yǎng)過程最適接種量和最適移種時間，并針對對數(shù)生長期及移種時的菌體濃度建立了數(shù)學預(yù)測模型。

1 材料與方法
1.1 實驗用菌株
出發(fā)菌為地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）U-32，由同聯(lián)集團上海研究所提供；實驗用菌種為出發(fā)菌原生質(zhì)體再生后篩選得到的Y-14高產(chǎn)菌株。
1.2 培養(yǎng)方法
1.2.1 種子培養(yǎng)基[7]：母瓶與子瓶培養(yǎng)基配方相同。
1.2.2培養(yǎng)方法：甘油管接母瓶（一級種子），搖床培養(yǎng)48小時后轉(zhuǎn)接子瓶（二級種子），子瓶于pH搖床上培養(yǎng)2天左右轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，發(fā)酵瓶在搖床上培養(yǎng)120小時放瓶。
1.3 主要儀器設(shè)備
SPY50雙層培養(yǎng)搖床（上海離心機械研究所）；SHpH-6型pH控制－補料搖床（上海國強生化工程裝備有限公司）。
1.4 測定方法
菌濃為PMV法；化學效價為分光光度法[8]；pH為pH搖床在線測量及pH計離線測量。

2 結(jié)果與討論
2.1 最適移種時間及接種量
2.1.1最適移種時間的判定
將母瓶按一定的接種量轉(zhuǎn)接子瓶，后者分別在pH搖床上在線測量pH值及在普通搖床上以多個平行搖瓶離線取樣測定pH值，以檢驗二者在pH測量及變化趨勢上是否存在差異。
從Fig. 1看出，普通搖床和pH搖床所培養(yǎng)的子瓶，其pH變化趨勢基本一致，但普通搖床搖瓶的pH測定結(jié)果波動較大，而pH搖床所顯示的pH變化趨勢更為連貫，可以更好地反映pH的細微變化和用于代謝分析。以上利福霉素種子瓶pH的變化規(guī)律簡述如下：
A點～B點（8～16h）由于葡萄糖作為碳源和能源被菌體利用而產(chǎn)生酸性中間代謝物導致pH下降；
B點～C點（16～30h）估計此時可快速利用的碳源已經(jīng)短缺，而淀粉的水解速率相對偏低，菌體開始利用有機氮源作為碳骨架導致pH回升；
C點～D點（30～44h）可能此時葡萄糖利用限制與淀粉水解之間的矛盾得到緩解，釋放出較多的糖代謝中間產(chǎn)物如有機酸等，導致pH再次下降；
D點（±44h）之后pH再次小幅回升，可能是由于碳源缺乏及菌體的開始少量自溶引起，推測此時應(yīng)是移種的關(guān)鍵時刻。在此點（44h）前后分別移種轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶測試菌種發(fā)酵能力，結(jié)果見Fig. 2。





由Fig. 1和Fig. 2可知，當種子培養(yǎng)過程pH到達第二個低谷（在此接種量下約為44h）時種子的產(chǎn)素能力最強；而且44h左右菌體正處于對數(shù)生長期末期（見Fig. 4），可見對利福霉素發(fā)酵來說選擇對數(shù)生長期末期移種較為合適。

2.1.2 最適接種量
分別按2％、4％、6％、8％的接種量從母瓶轉(zhuǎn)接到子瓶，檢測后者培養(yǎng)過程pH變化曲線，結(jié)果見Fig. 3。


由Fig. 3可見幾種不同接種量的種子培養(yǎng)過程的pH曲線的變化趨勢基本一致（2％接種量時，在圖示范圍內(nèi)pH沒有出現(xiàn)第二個低谷），不同之處在于形成峰值和低谷值的時間不同，說明這幾種情況下菌體的生理代謝過程相似，即接種量沒有超出正常范圍。當接種量太小或太大時種子培養(yǎng)過程的pH曲線同F(xiàn)ig. 3相比已發(fā)生較大變化（數(shù)據(jù)略）。
在Fig. 3所示接種量范圍內(nèi)，由于開始培養(yǎng)時菌體濃度不同，造成對營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢程度不同。接種量大，營養(yǎng)物質(zhì)消耗快，菌體生長也快， pH曲線上表現(xiàn)為低谷值及峰值出現(xiàn)較早，可見最適移種時間會隨接種量的增大而提前，Tab. 1比較了幾種不同接種量下的最適移種時間及其相應(yīng)產(chǎn)素能力。

Tab. 1 The titers of rifamycin fermentation resulting from different inoculum sizes of vegetative seed cultivation


* 此幾種接種量下的移種時間是指pH曲線分別到達第二個低谷的時間。

由Tab. 1可見，接種量6％和8％的子瓶的產(chǎn)素能力最高，隨接種量的增大或減小產(chǎn)素能力有所下降。接種量過大或過小，會對菌體的生長產(chǎn)生一定的影響，從而在一定程度上影響了菌濃及菌絲質(zhì)量（見Tab. 2），最終導致產(chǎn)素能力下降，故接種量應(yīng)選擇6％～8％較為合適。

2.2菌濃預(yù)測模型的建立
2.2.1假設(shè)條件
菌濃預(yù)測模型的建立，基于以下假設(shè)。
（1）利福霉素產(chǎn)生菌在生長過程中經(jīng)歷四個階段：遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和衰亡期。由遲滯期轉(zhuǎn)向?qū)��?shù)生長期的條件是：菌體濃度要達到某個閾值Cm，只有達到了這個閾值菌體才可進入對數(shù)生長期，通常Cm > a，a為初始菌濃。
（2）遲滯期菌體主要是為下一步的生長作物質(zhì)的準備，菌體緩慢生長，因此假設(shè)遲滯期所用的時間和菌體的初始濃度成反比。
（3）兩種不同的接種量下，若菌體培養(yǎng)過程pH曲線變化趨勢一致，則可以假設(shè)當pH達到第二個峰值時（如Fig. 1 C點所示）兩個搖瓶的菌體量相同（本實驗條件下菌濃測定值為12%）。原因是接種的菌體量相對于此時的菌體量很小可以忽略，而在此時二者的營養(yǎng)物質(zhì)消耗基本一致，故產(chǎn)生的菌體量也應(yīng)該相同。
2.2.2 菌濃預(yù)測模型的建立
分別從母瓶中按4%和6％的接種量轉(zhuǎn)接子瓶，在pH搖床上實時記錄培養(yǎng)過程pH變化趨勢，如Fig. 3所示。由Fig. 3知二者pH達到峰值的時間分別為t1 = 38 h，t2 = 32 h；由于母瓶移種時菌濃為15％，故實際接種量（即接種后子瓶中實際菌濃）a1 = 0.6%，a2 = 0.9%，菌體的倍增時間td = 14 h。

根據(jù)假設(shè)條件， 可得遲滯期方程
(1)
對數(shù)生長期的菌濃方程

(2)
由方程（2）可得：

(3)

(4)

2.2.3 模型驗證與誤差估計
6％接種量下的子瓶對數(shù)生長期的菌濃模型預(yù)測值與實測值如Fig. 4所示。

（—□－Predicted PMV； －●－Actual PMV）

由Fig. 4看出，模型預(yù)測值與實測值基本吻合，只是在對數(shù)生長前期及外推至對數(shù)生長末期（此接種量下為44h，即pH變化的第二個低谷值）誤差略大，原因有：一是對數(shù)生長前期實測菌濃由于固體培養(yǎng)基的存在對菌濃的實際值產(chǎn)生了干擾，而對數(shù)生長末期菌體已經(jīng)向穩(wěn)定期過渡，已不是純粹的對數(shù)生長；二是模型本身存在一定的偏差，因為遲滯期和初始的接種量不一定是線性關(guān)系，同時模型所采用的倍增時間可能與真實的倍增時間有一定的偏差。


預(yù)測模型與實測值之間的相對誤差值如Fig. 5所示，雖然模型和實測值在對數(shù)生長前期和后期誤差略大，但總體上誤差比較小，一般在5％以內(nèi)。另外，由Tab. 2可見其它接種量下，移種時間的模型預(yù)測值和實測菌濃誤差也較小，個別誤差較大的原因分析見下文討論部分。
綜上所述，可見本模型能夠較準確地預(yù)測種子培養(yǎng)過程中對數(shù)生長期的菌絲濃度變化。

Tab. 2 The predicted and actual PMV of seeds with different inoculum amount
at the optimal transfer occasion
* 接種量較大時，計算接種后初始菌濃應(yīng)考慮接種后的體積變化。

2.2.4 模型討論
（1）本模型能夠預(yù)測種子培養(yǎng)過程中的菌絲濃度變化，但是存在一定的局限性。主要是它受培養(yǎng)條件的影響，只有在培養(yǎng)基成份不變、培養(yǎng)環(huán)境不變時本模型才適用，否則模型參數(shù)需重新估計。
（2）本模型在適宜的接種量范圍內(nèi)準確度較高，但隨接種量的偏離程度的增加準確度會有所減小，原因可能是此時菌體的生長與建模時的假定條件有所偏離。
（3）本模型不但可以預(yù)測移種時的菌濃，而且同樣能夠預(yù)測在一定接種量下達到預(yù)定菌濃所需的培養(yǎng)時間，這可為生產(chǎn)進度安排提供方便。
（4）不同批次種子瓶的移種時機可能會略有不同，在發(fā)酵過程中純粹以培養(yǎng)時間來確定移種時機是不可取的，而要根據(jù)菌體濃度、菌體形態(tài)、生化檢測指標等綜合判定。


3 結(jié)論
本文利用pH搖床得到了利福霉素SV的最適移種時機為對數(shù)生長期末期，但具體移種時間會因接種量的改變而延長或縮短；研究顯示利福霉素SV種子培養(yǎng)過程最適接種量為6～8％（v/v）；為了預(yù)測移種時的菌體濃度，本文建立了菌濃預(yù)測模型，檢驗證明該模型能夠較準確地預(yù)測對數(shù)生長期及移種時菌濃，同時該模型也可用于根據(jù)接種量來預(yù)測達到預(yù)定菌濃的時間，為種子移種時機的判斷提供依據(jù)。

符號說明：
a： 初始接種量（即接種后子瓶中實際菌濃）
a1：接種量為4％時接種后子瓶中實際菌濃
a2：接種量為6％時接種后子瓶中實際菌濃
β：遲滯期系數(shù)
C：對數(shù)生長期的菌濃
C1：接種量為4％時pH達到第二峰值的菌濃
C2：接種量為6％時pH達到第二峰值的菌濃
Cm：菌體進入對數(shù)生長期必需達到的濃度閾值
PMV：以離心質(zhì)量法計算的菌體濃度
t：對數(shù)生長期內(nèi)的任一時間
t1：接種量為4％時pH達到第二峰值的時間
t2：接種量為6％時pH達到第二峰值的時間
td：菌體倍增時間
τ：遲滯期
τ1：接種量為4％時的遲滯期
τ2：接種量為6％時的遲滯期

參 考 文 獻
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