納米流式檢測(cè)技術(shù) (nFCM) 評(píng)估六種膜燃料標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的性能研究

細(xì)胞外囊泡 (EVs) 憑借其攜帶生物活性分子并精準(zhǔn)傳遞至特定靶細(xì)胞的卓越能力，在診斷與治療領(lǐng)域展現(xiàn)出極為廣闊的應(yīng)用前景。準(zhǔn)確表征和定量EVs對(duì)于理解其功能和臨床相關(guān)性至關(guān)重要。在EVs研究與轉(zhuǎn)化應(yīng)用過(guò)程中，熒光標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于EVs的表征。但固有的異質(zhì)性以及缺乏通用的蛋白標(biāo)記物等因素，使該方法面臨諸多挑戰(zhàn)。諸如一系列亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題：如何判斷自制EVs的質(zhì)量是否符合標(biāo)準(zhǔn)？怎樣客觀評(píng)價(jià)EVs的純度？是否存在通用型染料能夠特異性識(shí)別EVs？在種類(lèi)繁多的熒光染料中，如何篩選出性能最優(yōu)的標(biāo)記工具？

帶著這些問(wèn)題，NanoFCM英國(guó)團(tuán)隊(duì)聯(lián)合Oxford Brookes大學(xué)以及Sheffield Hallam大學(xué)在Journal of extracellular biology發(fā)表一篇題為“Shining a light on fluorescent EV dyes: Evaluating efficacy, specificity and suitability by nano-flow cytometry”的研究論文。本研究通過(guò)納米流式檢測(cè)技術(shù) (nFCM) 在單顆粒水平從EVs 的標(biāo)記效率、特異性和通用性等多個(gè)維度綜合評(píng)估了六種商品化的熒光染料。研究者旨在為EVs的熒光標(biāo)記提供一種系統(tǒng)性的評(píng)估方法，并為選擇合適的膜染料提供有價(jià)值的參考依據(jù)，從而推動(dòng)EVs的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。

一、膜染料最佳濃度確認(rèn)
研究者選取六種商品化膜染料（表1）。為了確定每種染料與EVs的最佳結(jié)合比例，研究者開(kāi)展了一系列濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)EVs的高效標(biāo)記，同時(shí)最大程度地降低因染料過(guò)量而引發(fā)的背景熒光干擾。研究者將SW480細(xì)胞系來(lái)源的EVs稀釋到2×1010particles/mL的濃度，分別與不同濃度梯度的膜染料進(jìn)行孵育。憑借nFCM高靈敏檢測(cè)性能以及其實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)背景水平的能力，通過(guò)分析熒光陽(yáng)性率和熒光背景水平來(lái)評(píng)估染料的性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，每種染料均存在最佳標(biāo)記濃度：在此濃度下，EVs的熒光陽(yáng)性率能夠達(dá)到峰值，同時(shí)熒光背景水平被有效控制在較低水平（圖1D-G）。進(jìn)一步分析原始數(shù)據(jù)，研究者觀察到當(dāng)膜染料的濃度過(guò)高時(shí)，熒光背景水平顯著升高，從而掩蓋了弱熒光信號(hào)，使得EVs的標(biāo)記效果大打折扣（圖1A）；相反，當(dāng)膜染料的濃度適中時(shí)，EVs的標(biāo)記效率顯著提高，且熒光背景維持在較低水平。這種平衡使得檢測(cè)到的熒光信號(hào)清晰可辨，能夠有效區(qū)分信號(hào)和背景噪聲，從而確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性（圖1B）。然而，如果膜染料的濃度過(guò)低，許多EVs將無(wú)法被染色，導(dǎo)致標(biāo)記效率低下，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的整體效果（圖1C）。

表1. 膜染料基本情況

圖1. 通過(guò)nFCM優(yōu)化膜染料濃度

二、膜染料標(biāo)記效率對(duì)比
為了評(píng)估不同膜染料的標(biāo)記效率和特異性，研究者選取了SW620和SW480兩種細(xì)胞來(lái)源的EVs進(jìn)行膜染料標(biāo)記，并通過(guò)nFCM檢測(cè)熒光陽(yáng)性率。結(jié)果顯示，CMDR、MemGlow 640和MemGlow 488在兩種細(xì)胞來(lái)源EVs的標(biāo)記效率均較高，陽(yáng)性率超過(guò)95%；相較之下，ExoBrite 490/515 和ExoBrite 640/660在SW620來(lái)源EVs的標(biāo)記效率較低，低于50%（圖2a-g）。研究者進(jìn)一步采用5% Triton X-100處理所有樣本以驗(yàn)證標(biāo)記特異性。結(jié)果顯示，處理后，SW620來(lái)源EVs顆粒濃度降低了68.6%，而SW480來(lái)源EVs的顆粒濃度降低幅度更大，達(dá)到了73.4%（圖2h）。這一結(jié)果不僅證實(shí)了染料標(biāo)記的特異性，還揭示了不同細(xì)胞系來(lái)源的EVs在膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上可能存在差異。
 

圖2. 六種膜染料標(biāo)記SW620和SW480來(lái)源EVs的標(biāo)記效率

為了進(jìn)一步驗(yàn)證染料對(duì)EVs的標(biāo)記效率和特異性，研究者將膜染料與抗四跨膜蛋白抗體 (CD9、CD63、CD81) 進(jìn)行了共標(biāo)記。通過(guò)分析四跨膜蛋白陽(yáng)性顆粒中膜染料標(biāo)記的百分比來(lái)評(píng)估染料的標(biāo)記效率和特異性。結(jié)果顯示，MemGlow 640、CMDR和MemGlow 488的標(biāo)記效果最佳，熒光陽(yáng)性率大于95%（圖3a）。未能被染料標(biāo)記的四跨膜蛋白陽(yáng)性顆粒的粒徑遠(yuǎn)小于被標(biāo)記的顆粒（圖3b-e），這可能是由于小粒徑EVs表面靶標(biāo)（如GM1 糖鞘脂或酯酶）表達(dá)量過(guò)低而影響了染料的標(biāo)記效率。
 

圖3. 不同膜染料與三種抗四跨膜蛋白抗體共標(biāo)記

三、膜染料自團(tuán)聚對(duì)比
膜染料的自團(tuán)聚可能會(huì)導(dǎo)致染料形成與EVs大小相似的熒光顆粒，并在熒光檢測(cè)中產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。為了評(píng)估自團(tuán)聚現(xiàn)象，研究者將每種膜染料分別與無(wú)顆粒磷酸鹽緩沖液 (PBS) 進(jìn)行標(biāo)記，以確定是否產(chǎn)生自團(tuán)聚。結(jié)果顯示，在最佳標(biāo)記濃度下，所用膜染料緩沖液中形成的熒光陽(yáng)性顆粒數(shù)量極低（圖4a-g）。這表明所選熒光染料自團(tuán)聚對(duì)EVs脂膜標(biāo)記結(jié)果影響較小。
 

圖4. 膜染料在PBS中自團(tuán)聚情況

四、膜染料特異性對(duì)比
為了評(píng)估膜染料是否會(huì)特異性地標(biāo)記其他脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究者嘗試用膜染料標(biāo)記極低密度脂蛋白 (VLDLs)。結(jié)果顯示，MemGlow 488和MemGlow 640對(duì)VLDLs的標(biāo)記效率接近100%，而其他膜染料標(biāo)記比例均低于15%（表2）。這表明MemGlow系列染料對(duì)VLDLs存在顯著性結(jié)合。

為了進(jìn)一步評(píng)估膜染料在復(fù)雜環(huán)境中的標(biāo)記特異性，研究者利用血漿來(lái)源EVs進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，CMDR、MemGlow 488和MemGlow 640呈現(xiàn)出較高的標(biāo)記效率，而ExoBrite 640/660、CTDR和ExoBrite 490/515的標(biāo)記比例均低于15%（表2）。

綜上結(jié)果表明，MemGlow 488和MemGlow 640雖在血漿EVs中具備高效標(biāo)記能力，但其對(duì)VLDLs的強(qiáng)非特異性親和力會(huì)干擾復(fù)雜樣品中EVs的準(zhǔn)確檢測(cè)，限制了它們的應(yīng)用場(chǎng)景。而CMDR不僅能高效標(biāo)記血漿EVs，同時(shí)對(duì)VLDLs的非特異性結(jié)合較低，更適合在復(fù)雜生物樣本中使用。

表2. 膜染料標(biāo)記VLDLs和血漿來(lái)源EVs陽(yáng)性率

五、膜染料亮度對(duì)比
熒光強(qiáng)度是評(píng)估染料性能的關(guān)鍵指標(biāo)之一，它直接關(guān)系到EVs在不同靈敏度儀器的檢測(cè)效果。高亮度的染料不僅能夠提升對(duì)微小細(xì)胞外囊泡的檢測(cè)能力，還能在低靈敏度儀器上實(shí)現(xiàn)EVs的有效檢出。這不僅拓寬了EVs的檢測(cè)范圍，還能提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。為了量化評(píng)估染料的亮度，研究者提出了染色指數(shù) (stain index) 的概念。染色指數(shù)是熒光陽(yáng)性群體與陰性群體的MFI差值與陰性群體熒光背景水平的兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的比值。染色指數(shù)越高，表明染料的亮度越高。結(jié)果顯示，MemGlow 488的亮度最高，染色指數(shù)高達(dá)242.4（圖5a）。相比之下，ExoBrite 490/515和ExoBrite 640/660的亮度較低，染色指數(shù)分別為12.5和10.0（圖5b）。此外，nFCM原始信號(hào)脈沖圖直觀呈現(xiàn)了不同染料標(biāo)記的EVs的熒光信號(hào)強(qiáng)度差異（圖5c, d），進(jìn)一步驗(yàn)證了上述量化分析結(jié)果，為染料選擇提供了可視化依據(jù)。
 

圖5. 不同膜染料的熒光亮度

總結(jié)
研究者從標(biāo)記效率、特異性、亮度和自團(tuán)聚四個(gè)方面系統(tǒng)性評(píng)估六種膜染料在EVs標(biāo)記中的性能（表3）。結(jié)果顯示，MemGlow 488和MemGlow 640在標(biāo)記效率和亮度方面表現(xiàn)出色，但對(duì)VLDLs的高親和力限制了它們?cè)趶?fù)雜生物樣本中的應(yīng)用。CMDR則在特異性和低背景熒光方面表現(xiàn)出色，適合在復(fù)雜生物樣本中使用。此外，研究者提出了未來(lái)研究的方向，包括拓展染料篩選范圍、優(yōu)化標(biāo)記方法、多平臺(tái)驗(yàn)證以及選取更多樣化的臨床樣本等。這些發(fā)現(xiàn)不僅為EVs研究中染料的合理選擇提供了科學(xué)依據(jù)，也為改進(jìn)EVs標(biāo)記技術(shù)、評(píng)估/優(yōu)化分離純化流程、制定EVs質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了新思路，有望進(jìn)一步推動(dòng)EVs的臨床應(yīng)用。

表3. 膜染料性能對(duì)比