放血對低壓缺氧所致幼鼠骨退化的治療作用

文獻信息
西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院生物樣本庫、青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心等的研究成果《Therapeutic effect of bloodletting on bone deterioration induced by hypobaric hypoxia in young rats》（放血對低壓缺氧所致幼鼠骨退化的治療作用）在期刊《Bone》上發(fā)表。平生公司的離活一體CT（NEMO）在論文中提供了重要的大鼠股骨圖像和定量分析結(jié)果。

該論文的通訊作者為湯峰，鄔云紅，第一作者為郝豆豆。

文獻摘要
目的：高海拔地區(qū)，包括缺氧條件，與不同的海拔引起的病理有關(guān)，包括骨密度降低。闡明這種環(huán)境下骨退化的機制和開發(fā)有針對性的干預(yù)和治療方法是很重要的。放血療法具有良好的臨床應(yīng)用前景，但其對骨骼系統(tǒng)和骨穩(wěn)態(tài)的影響尚不清楚。本研究旨在探討低壓缺氧環(huán)境對幼年SD大鼠特定股骨形態(tài)和結(jié)構(gòu)特性的影響，包括骨體積、皮質(zhì)厚度和小梁微結(jié)構(gòu)，并探討放血干預(yù)對這些參數(shù)的潛在調(diào)節(jié)作用。

方法：6周齡雄性SD大鼠，模擬5000-m海拔的低氣壓缺氧環(huán)境，持續(xù)12周。放血干預(yù)組大鼠每周尾靜脈抽血500 μL。采用Micro-CT技術(shù)、蘇木精和伊紅染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色綜合評價股骨微結(jié)構(gòu)、組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)。此外，通過免疫熒光分析來量化關(guān)鍵蛋白的表達，并通過轉(zhuǎn)錄組分析來鑒定差異表達基因。
結(jié)果：暴露在低氧環(huán)境下的大鼠骨礦物質(zhì)含量、骨小梁數(shù)量和骨皮質(zhì)厚度明顯減少，表明骨微結(jié)構(gòu)惡化。此外，缺氧環(huán)境上調(diào)RANKL和HIF-1α的表達，下調(diào)RUNX2的表達。值得注意的是，盡管放血干預(yù)并沒有顯著逆轉(zhuǎn)這些骨結(jié)構(gòu)變化，但轉(zhuǎn)錄組分析揭示了放血干預(yù)對關(guān)鍵基因表達的調(diào)節(jié)作用，尤其是Mmp2、Fosl2和URS0000B2A65A，這些基因與缺氧反應(yīng)、破骨細胞分化和PI3K-Akt信號通路有關(guān)。
  結(jié)論：本研究強調(diào)了低壓缺氧對幼年大鼠骨骼微觀結(jié)構(gòu)的不利影響，并強調(diào)了放血改善這種情況的治療潛力。此外，對放血對基因表達影響的調(diào)控機制的研究為骨改變提供了新的視角。它為開發(fā)新的預(yù)防措施和靶向治療方法提供了有希望的途徑，以解決相關(guān)骨疾病帶來的挑戰(zhàn)。

實驗方法
動物準備
選用雄性無特定病原體級SD大鼠30只，4-6周齡。在1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)期后，將大鼠隨機分為正常對照組（NC）、低壓缺氧組（HH）和低壓缺氧放血組（HH- BL），每組10只。對照組大鼠飼養(yǎng)在青海大學(xué)動物飼養(yǎng)設(shè)施（海拔2261 m）， HH組和HH- BL組大鼠飼養(yǎng)在模擬海拔5000 m（大氣壓力54 kPa）的9000 × 3200 × 3200 mm的低壓缺氧艙中所有大鼠維持12小時的光照/黑暗周期，并給予標準顆粒飼料（由中國北京高協(xié)和飼料有限公司提供）和隨意飲水。動物室溫和濕度分別保持在20±2◦C和60±5%。HH組和HH- bl組大鼠連續(xù)置于低壓缺氧艙12周，每周更換籠褥和設(shè)備。在換料和換料期間，海拔高度調(diào)整為3500 m（大氣壓64.9 kPa），其余時間保持5000 m的模擬海拔高度。HH-BL組大鼠每周尾靜脈抽血500 μL，連續(xù)12周。

Micro CT掃描
安樂死后，取大鼠左股骨標本，快速浸泡在含有0.1 M磷酸鈉（pH 7.0）的4%多聚甲醛固定液中，以確保保存標本的原始形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。為了進一步探索股骨的微結(jié)構(gòu)，作者采用了高分辨率Micro CT技術(shù)（NEMO，NMC-100,平生醫(yī)療科技有限公司）。在掃描過程中，樣品被放置在X射線源和高性能CMOS探測器之間。樣本在掃描區(qū)域內(nèi)沿其垂直長軸進行了360度旋轉(zhuǎn)，總共進行了4000次精確的投影。具體掃描參數(shù)設(shè)置為：電壓90 kV，電流0.06 mA。掃描完成后，作者利用Avatar v1.6.9.3軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）對采集到的數(shù)據(jù)進行了深入的三維重建和綜合分析。作者選擇感興趣區(qū)域（ROI）來評估股骨的微觀特征，如下所示：首先，關(guān)注位于距股骨干骺端生長板1.5 mm處的2 mm高的骨小梁區(qū)域；其次，對距離生長板10 mm的2 mm長的皮質(zhì)骨段進行分析，得到皮質(zhì)骨厚度、骨礦物質(zhì)含量、骨小梁體積分數(shù)、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨小梁間距等關(guān)鍵指標數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果
為了評估慢性低氧對大鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響和放血治療的潛在作用，作者對大鼠股骨微結(jié)構(gòu)進行了詳細的分析。基于Micro CT，在ROI中檢查股骨干骺端和皮質(zhì)骨（圖2A -  B），三維圖像顯示冠狀面、矢狀面和軸向面（圖2C - F）。Micro CT分析顯示，低氣壓缺氧組皮質(zhì)骨量顯著減少，表現(xiàn)為皮質(zhì)厚度、骨礦物質(zhì)含量和皮質(zhì)骨體積減少。然而，放血治療并沒有顯著改善低氣壓缺氧大鼠的皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)（圖2g - 1）。脛骨生物力學(xué)測試顯示，在12周的低氣壓缺氧后，最大骨折力下降，表明骨力學(xué)性能降低，而放血治療傾向于改善這一點（圖2J）。在股骨小梁骨中，低氣壓缺氧組表現(xiàn)出明顯的骨丟失，骨小梁分離增加，骨礦物質(zhì)含量、骨小梁體積分數(shù)和骨小梁數(shù)量減少，但骨小梁厚度無明顯變化。雖然放血治療導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)有所改善，但骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3e - 1）。這些發(fā)現(xiàn)為慢性低壓缺氧對骨骼系統(tǒng)的影響和放血的潛在治療效果提供了有價值的見解。

圖2所示。低氧缺氧對年輕雄性SD大鼠皮質(zhì)骨退化的影響及放血治療的潛在緩解作用。(A-B) 分析骨骼微觀結(jié)構(gòu)的興趣體積（VOI）選擇的描述，其中粉紅色表示小梁骨，藍色表示皮質(zhì)骨。（C-F）在冠狀面、矢狀面和軸向面顯示股骨干骺端骨微觀結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的代表性三維圖像。（G-I）皮質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量分析，包括皮質(zhì)厚度（Ct.Th）、皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量（Ct.BMC）、皮質(zhì)骨體積（Ct.BV）。(J)生物力學(xué)分析揭示脛骨骨折的極限破壞載荷（UFL）。實驗采用正常對照組（NC）和低氧放血組（HH- bl）各10只大鼠和低氧放血組（HH）各9只大鼠。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，采用Bonferroni校正的單因素方差分析評估統(tǒng)計顯著性。* p < 0.01；** p < 0.0001。

使用結(jié)論
綜上所述，放血治療對大鼠無不良影響，且未對本研究測量的任何骨參數(shù)產(chǎn)生明顯改變。然而，在骨髓細胞和干骺端骨組織的表達模式中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因的功能驗證，受低壓缺氧和放血治療的調(diào)節(jié)，尚未在體外進行，這是研究的關(guān)鍵下一步。然而，這一研究結(jié)果有望為預(yù)防和治療因低氣壓缺氧所引發(fā)的骨疾病的提供新策略。

使用設(shè)備

  Micro CT (型號：NEMO) (平生醫(yī)療科技)
影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）