文獻解讀：山東大學齊魯醫(yī)院等團隊揭示CDC6蛋白的去泛素化機制

細胞分裂周期蛋白6（CDC6）在DNA復制過程中發(fā)揮重要作用。作為前復制復合物（pre-RC）中的核心成員，如果CDC6發(fā)生突變或缺失，pre-RC將無法組裝，DNA復制也會受到抑制。由于CDC6在細胞周期進程中扮演著關鍵角色，其畸變會導致各種生理和病理變化。在肺癌、結腸癌和乳腺癌等多種癌癥中都觀察到CDC6的異常上調，并與預后不良有關。

因此，CDC6在細胞周期中的表達須受到嚴格調控。不過，在整個細胞周期中，CDC6蛋白水平與其mRNA水平的變化趨勢并不一致，這表明翻譯后調控可能參與了CDC6蛋白水平的控制。CDC6可被多種E3泛素連接酶復合體泛素化，但它是否受到去泛素化酶（DUB）的直接調控，目前還不清楚.

山東大學齊魯醫(yī)院鄒永新教授、史本康教授以及山東大學微生物技術國家重點實驗室武大雷教授和中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院邢念增教授領導的團隊發(fā)現，去泛素化酶OTUD6A介導了CDC6的去泛素化，OTUD6A通過上調CDC6來促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生。這項研究成果于近日發(fā)表在《Molecular Cancer》雜志上，為膀胱癌等癌癥的診斷和治療提供了新思路。

圖片來源：《Molecular Cancer》（https://doi.org/10.1186/s12943-024-01996-y）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員通過蛋白質組范圍的DUB篩選來鑒定CDC6的潛在調節(jié)因子。為確定OTUD6A的功能，他們開展了功能獲得和功能缺失實驗，體外實驗在多個癌細胞系上開展，體內實驗則使用了條件性Otud6a基因敲除（CKO）小鼠（由賽業(yè)生物提供）。他們還利用N-丁基-N-(4-羥丁基)-亞硝胺（BBN）誘導了膀胱癌小鼠模型，以分析OTUD6A-CDC6軸在體內的作用。

技術路線
01 通過蛋白質組范圍的DUB篩選，發(fā)現OTUD6A對CDC6蛋白有明顯的上調作用
02 通過多種分析確定OTUD6A能夠直接與CDC6相互作用并逆轉其泛素化
03 體外和體內分析表明，OTUD6A通過上調CDC6促進細胞增殖和腫瘤發(fā)生
04 高水平的OTUD6A和CDC6與膀胱癌患者的預后不良有關

研究結果
1. OTUD6A正向調節(jié)CDC6的蛋白水平
為了系統地鑒定CDC6的潛在調節(jié)因子，研究人員開展了蛋白質組范圍的DUB篩選。他們發(fā)現，去泛素化酶OTUD6A對CDC6蛋白水平具有最強的上調作用。在HEK293等細胞中穩(wěn)定過表達OTUD6A會增加CDC6的蛋白水平，但不會增加其mRNA水平。相反，使用shRNA對OTUD6A進行敲降則會顯著降低CDC6蛋白水平，但對其mRNA水平沒有影響。

為了證實體內OTUD6A對CDC6的調節(jié)作用，他們將Otud6aflox/flox小鼠（由賽業(yè)生物提供）與Dppa3-Cre小鼠雜交，產生了條件性Otud6a基因敲除（CKO）小鼠。與野生型小鼠相比，CKO小鼠的生長曲線在出生后18天開始出現顯著差異，小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）增殖要慢得多，且CKO小鼠的大部分組織表現出較低的CDC6蛋白表達。這些結果表明，OTUD6A在體外和體內都能正向調節(jié)CDC6的蛋白水平。

那么，OTUD6A與CDC6是否存在直接的相互作用？免疫熒光染色結果顯示，OTUD6A與CDC6共定位在細胞核和細胞質中。免疫共沉淀分析證實，CDC6和OTUD6A在全細胞裂解液中相互共沉淀，且OTUD6A的N端區(qū)域介導了其與CDC6的相互作用。雙分子熒光互補（BiFC）等分析也證實了兩者之間存在直接的相互作用。更重要的是，它們之間的相互作用在S期晚期被檢測到，且主要發(fā)生在G2/M期，與CDC6蛋白水平的變化趨勢相同。

2. OTUD6A去除CDC6上的多泛素鏈并維持CDC6的穩(wěn)定性
考慮到OTUD6A在轉錄后水平調節(jié)CDC6的表達，研究人員首先研究了OTUD6A對CDC6蛋白穩(wěn)定性的影響。在OTUD6A過表達的細胞中，CDC6蛋白的半衰期延長，而敲降或敲除OTUD6A則導致其半衰期縮短（圖1），這表明OTUD6A抑制了CDC6的降解。后續(xù)的研究發(fā)現，蛋白酶體抑制劑MG132的處理能夠有效恢復OTUD6A敲降所導致的CDC6蛋白水平下降，表明OTUD6A可能通過泛素-蛋白酶體系統來調節(jié)CDC6蛋白的穩(wěn)定性。

去泛素化酶通過去除泛素鏈來維持底物的穩(wěn)定性。體外去泛素化分析證實，OTUD6A可去除CDC6上的多泛素鏈；相反，敲降OTUD6A會增加CDC6的多泛素化（圖1）。研究人員還發(fā)現，OTUD6A的去泛素化酶死亡突變體（C152A突變體）失去了上調CDC6蛋白的能力，也未能減少內源性和外源性CDC6的多泛素化。后續(xù)分析還顯示，OTUD6A去除了CDC6上K6、K33和K48連接的多泛素鏈。這些數據表明，OTUD6A可維持CDC6的穩(wěn)定性，并逆轉APC/C-CDH1和SCF-Cyclin F引起的CDC6降解。
 

圖1 OTUD6A去除CDC6上的多泛素鏈并維持CDC6的穩(wěn)定性[1]

3. OTUD6A-CDC6軸促進了癌細胞的致瘤性
研究人員推測，OTUD6A可能像CDC6一樣，在細胞周期調控中發(fā)揮作用。于是他們分析了OTUD6A在細胞周期進程中的表達。結果顯示，U2OS細胞中的OTUD6A蛋白水平隨著細胞周期波動，在G2/M期達到峰值，然后在G1和S期下降。而且，內源性OTUD6A蛋白水平與CDC6的水平相當一致。此外，抑制OTUD6A或敲降CDC6都會導致G2/M期延遲，而過表達CDC6可減弱敲降OTUD6A誘導的G2/M期延遲，這表明OTUD6A以依賴CDC6的方式調節(jié)細胞周期進程。

根據這些結果，研究人員進一步推測，OTUD6A可能是一種致癌基因。他們發(fā)現，OTUD6A在膀胱癌細胞系中的表達遠高于尿路上皮細胞。CCK8、克隆形成和EdU摻入等實驗表明，OTUD6A的敲降可抑制癌細胞的增殖，而過表達可促進癌細胞增殖（圖2）。腫瘤異種移植小鼠模型上的結果也表明，敲降癌細胞中的OTUD6A能夠顯著抑制腫瘤生長。同時，體外和體內的CDC6異位表達能夠有效逆轉OTUD6A敲降介導的癌細胞增殖和腫瘤生長抑制。這些結果表明，OTUD6A通過上調CDC6而促進人類癌細胞的致瘤性。

此外，研究人員還采用了BBN誘導的膀胱癌小鼠模型，這是探索膀胱腫瘤發(fā)生機制的常用方法。IHC染色顯示，OTUD6A、CDC6和Ki-67蛋白水平隨著BBN處理時間的延長而升高，表明OTUD6A和CDC6可能在膀胱腫瘤發(fā)生中起作用。值得注意的是，OTUD6A的敲除會導致BBN處理后膀胱腫瘤發(fā)生減少、惡性程度降低及CDC6蛋白水平降低（圖2），表明OTUD6A的敲除能夠抑制化學致癌物誘導的膀胱腫瘤發(fā)生和CDC6蛋白表達。

圖2 OTUD6A-CDC6軸促進腫瘤生長[1]

DNA損傷應答（DDR）的增強是細胞化療耐藥的重要機制之一。CDC6被認為是促進DDR激活的一個重要因素�？紤]到OTUD6A能夠穩(wěn)定CDC6蛋白，研究人員接下來分析了OTUD6A是否也在DDR和化療應答中發(fā)揮作用。通過體外和體內分析，他們發(fā)現OTUD6A的抑制會提高腫瘤細胞的化療敏感性，且OTUD6A的敲降或敲除也會增加腫瘤細胞的DNA損傷。進一步分析表明，OTUD6A促進CDC6-ATR-Chk1信號通路的活性，并賦予腫瘤細胞化療耐藥性。

4. 高水平的OTUD6A和CDC6與癌癥預后不良有關
最后，研究人員分析了OTUD6A介導的CDC6上調是否具有潛在的臨床意義。他們檢測了20例人類膀胱癌組織和癌旁正常組織中OTUD6A和CDC6的表達水平。膀胱癌組織中OTUD6A和CDC6的蛋白和mRNA水平均高于匹配的正常膀胱組織，且CDC6蛋白水平與OTUD6A蛋白水平呈正相關。

他們還觀察到，若膀胱癌患者的OTUD6A或CDC6水平相對較高，則總生存期（OS）較差。值得注意的是，OTUD6A和CDC6的聯合高水平與膀胱癌患者預后較差有更強的相關性，OTUD6A水平高而CDC6水平低的患者比OTUD6A水平低而CDC6水平高的患者有更好的預后。這些數據表明，OTUD6A-CDC6軸在膀胱癌中被優(yōu)先激活，其水平與患者生存期較差相關。因此，他們認為，OTUD6A和CDC6可作為膀胱癌患者的一組預后標志物。

研究結論

圖3 OTUD6A-CDC6軸調節(jié)細胞增殖和DNA損傷應答機制的示意圖[1]

總的來說，這項研究發(fā)現OTUD6A是CDC6的新型正向調節(jié)因子，在細胞周期、細胞增殖、機體生長、腫瘤發(fā)生、DNA損傷應答以及化療敏感性中發(fā)揮重要作用（圖3），有助于人們全面了解OTUD6A的生理和病理功能。這些數據還表明，OTUD6A-CDC6軸有望作為癌癥治療的臨床靶點。

參考文獻：[1]Cui, J., Liu, X., Shang, Q. et al. Deubiquitination of CDC6 by OTUD6A promotes tumour progression and chemoresistance. Mol Cancer 23, 86 (2024). https://doi.org/10.1186/s12943-024-01996-y

賽業(yè)小鼠模型構建

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品系名稱：C57BL/6NCya-Otud6aem1/Cya
產品編號： S-KO-10028
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Otud6a flox小鼠

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品系名稱：C57BL/6NCya-Otud6aem1flox/Cya
產品編號： S-CKO-11206
應用方向：神經,代謝,行為學等