各類免疫細胞表型分類、特點及功能

文章原創(chuàng)為：FACSelite 文章來源于：流式通

一般免疫亞群分析
General Immune Subset Profiling

流式細胞術常用于監(jiān)測治療或疾病進程對外周血細胞亞群和蛋白表達的影響，即免疫監(jiān)測。該技術涉及表面蛋白標記，以評估成熟細胞亞群。更深入的分析可結合細胞因子和轉錄因子。對于高參數(shù)檢測，推薦參考Cytometry Part B發(fā)布的OMIPs方案。

01.骨干標記
Backbone Markers

全血的一般骨干標記包括：

• CD34：造血干細胞和祖細胞
• CD45：泛造血系標記
• CD15或CD66b：PMN-MDSC，中性粒細胞，嗜酸性粒細胞
• CD14或CD33/CD11c：單核細胞
• CD19：B細胞
• CD56：NK和NKT細胞
• CD3：T細胞
• CD127：ILC
• CD123：漿細胞樣樹突狀細胞和嗜堿性粒細胞
• TCRV α7.2：MAIT細胞
• CD117：肥大細胞

包含CD34的目的是為了從分析中排除祖細胞，如果應用是白血病或其他血液相關惡性腫瘤，這可能非常重要，因為這些疾病是由淋巴母細胞的異常分裂引起的。同樣，如果通過Ficoll分離去除了像中性粒細胞和嗜酸性粒細胞這樣的多形核細胞，可能不需要CD66b或CD15。對于單核細胞的標記表型，另一種替代組合是使用CD33或CD64，而不是或除了CD14。

02.T淋巴細胞
T Lymphocytes

T淋巴細胞分類概覽：

T淋巴細胞的分類基于CD3陽性，并排除CD34、CD19和CD14。為了區(qū)分特定的T細胞亞群，需要檢測以下標記：

• γδ T細胞：γδTCR
• MAIT細胞：TCRV α7.2
• NKT細胞：TCRVα24-Jα18

CD56用于排除NKT和NK細胞，但需注意其在MAIT和γδT細胞上可能呈陽性或陰性。在分析時，應先對γδTCR、TCRV α7.2和TCRVα24-Jα18進行門控，再對CD56進行門控，以確保αβ T細胞的純凈度。

T細胞亞群的進一步分類：

CD4和CD8定義了T細胞的單陽性和雙陽性亞群，并通過以下標記的表達進一步區(qū)分為幼稚、效應或記憶狀態(tài)：

• CD197
• CD45RA
• CD27
• CD28

CD4+輔助性（Th）和CD8+細胞毒性（CTL或Tc）T細胞亞群通過以下組合來識別：

• CCR10
• CD183/CXCR3
• CD185/CXCR5
• CD194/CCR4
• CD196/CCR6

這些表面標記最好與細胞內(nèi)細胞因子或核轉錄因子的功能標記相結合，以增強分析的準確性。

特殊T細胞亞群：

T輔助濾泡（Tfh）細胞主要位于B細胞濾泡中心，由CXCR5+定義。濾泡調(diào)節(jié)性T（Tfr）細胞在表達CXCR5+方面與Tfh相似，但功能不同，主要調(diào)節(jié)B細胞的抗體反應。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）通常由CD25+/CD127lo/-定義，而Tfr細胞CD25/CD127的表達類似于Tregs。這些亞群的功能表型需要細胞因子或轉錄因子標記來進一步確認。先天淋巴細胞可能表達與T輔助和細胞毒性T細胞亞群相似的細胞因子和轉錄因子譜。

03.自然殺傷細胞亞群標記
Natural Killer Subset Markers

自然殺傷（NK）細胞與NKT細胞的區(qū)別在于NK細胞不表達CD3，而CD94+有助于確認NK細胞的身份。NK細胞的進一步分類為成熟NK（NK1）、終末NK（NK2）和早期NK（NK3）依賴于CD56 (bright vs dim)、CD127、CD16和CD57的表達水平和模式。由于某些先天淋巴細胞也可能表達CD56，因此區(qū)分CD3-/CD127+的先天淋巴細胞（ILC）和CD3-/CD127lo/-的NK細胞是必要的。

04.單核細胞
Monocytes

單核細胞和巨噬細胞概述：

- 單核細胞和巨噬細胞是免疫系統(tǒng)的關鍵組成部分，具有適應性和先天性免疫功能，主要負責清除微生物、腫瘤細胞和死亡細胞碎片。

- 單核細胞循環(huán)于血液中，而巨噬細胞主要駐留于組織中。

- 監(jiān)測巨噬細胞時，可使用CD80（M1型）和CD206（M2型）標記。

單核細胞分類：

- 單核細胞約占白細胞的10%，通過CD3-/CD14+/CD11c+標記定義。

- 根據(jù)CD16和HLA-DR的表達水平，單核細胞分為三類：

• 經(jīng)典型：(CD14 hi/CD16-/HLA-DR lo/CD11c lo)
• 中間型：(CD14 hi/CD16+/hi/ HLA-DR hi/ CD11c hi)
• 非經(jīng)典型：(CD14 low/CD16 hi/ HLA-DR+/ CD11c hi)

- HLA-DR的檢測有助于排除髓系來源的MSDC（Mo-MDSC），這些細胞表達CD3-/CD14+/CD16+/-HLA-DR-。

單核細胞功能：
- 經(jīng)典型單核細胞占外周血中單核細胞的80-90%，具有抗微生物和促炎功能，能分泌活性氧和IL-10，并可分化為Mo-MDSC。
- 中間型單核細胞主要負責抗原呈遞和凋亡調(diào)節(jié)。
- 非經(jīng)典型單核細胞參與抗病毒反應和Fc受體介導的吞噬作用，通過CX3CR1在血管中巡邏并招募MHC II+細胞。
- 激活后，中間型和非經(jīng)典型單核細胞分泌炎癥細胞因子，如IL-6、TNF-alpha和IL-1 beta。
- 經(jīng)典型和中間型單核細胞在功能上協(xié)同作用，受CCR2和CCR5指導侵入組織，分化為巨噬細胞或樹突狀細胞，并表達MHCII以激活T細胞。

05.B細胞
B cells

B淋巴細胞概述：
- B淋巴細胞是適應性免疫系統(tǒng)的關鍵成員，通過CD45+/CD3-/CD19+的標記來識別。
- CD19比CD20更受青睞，因為它是B細胞祖細胞上首先表達的特異性標記，而CD20在抗體分泌細胞（如漿細胞和漿細胞前體細胞）上會丟失。
- B細胞高度異質(zhì)化，需要產(chǎn)生多樣化的抗原受體（BCR）以及記憶、天真和效應亞群。
- 類別轉換是激活的B細胞改變其重鏈類型（從IgM和IgD到IgG、IgE或IgA）的過程，以優(yōu)化對特定病原體的體液免疫反應，不影響抗體的特異性，只影響其效應功能。
- B細胞和T細胞受體的特異性在V(D)J重組過程中確定。

B細胞亞群的識別：
- 在B細胞特異性方案中，常用CD20、CD10、CD5、CD27、CD38、IgD、IgM、CD24的組合。
- 在一般免疫分析中，通過CD10、CD27和IgD的組合來區(qū)分記憶B細胞亞群。

B細胞標記的表達：
- CD27在約40%的外周B細胞中表達，是B細胞具有抗原特異性記憶和產(chǎn)生免疫球蛋白能力的標記，其在漿細胞抗體分泌細胞（ASC）上的表達增加。
- 存在一個CD27-的B記憶細胞亞群，稱為雙陰性（DN）細胞，其功能仍在研究中。
- CD10是指示淋巴細胞和NK細胞命運祖細胞分化程度和譜系承諾的標記。
- 在B細胞發(fā)育中，IgM首先在骨髓中的Pre-B II祖細胞上表達，而B細胞在離開骨髓成為過渡B細胞后才表達細胞表面IgD。

06.粒細胞
Granulocytes

粒細胞是白細胞的一種，以其多葉核（多形核）、體積大（高前向散射FSC）和含有的蛋白質(zhì)及酶顆粒（高側向散射SSC）為特征。粒細胞包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。在流式細胞術中，嗜堿性粒細胞與中性粒細胞和嗜酸性粒細胞有顯著差異。

嗜堿性粒細胞：

• 嗜堿性粒細胞的散射特征較低，可能與單核細胞相似。
• 它們表達CD15或CD66b的水平低或不表達。
• 嗜堿性粒細胞的基本標記表型為CD45 lo/ CD3-/ CD14-/ CD66b-/CD123 hi。
• 嗜堿性粒細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）會落入同一群體，因此CD303+和HLA-DR+用于進一步定義pDC，而FcεR1a+用于定義嗜堿性粒細胞。
• 嗜堿性粒細胞占所有白細胞的1%，它們吞噬外來微生物，通過釋放組胺調(diào)節(jié)過敏反應，通過釋放肝素調(diào)節(jié)血液凝固。

中性粒細胞和嗜酸性粒細胞：

• 這兩種細胞表達CD15和CD66b。
• PMN-MDSC也表達CD15+/CD66b+，因此CD117+/Lox-1-可以識別中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，而CD177-/Lox-1+可以識別PMN-MDSC。
• 中性粒細胞和嗜酸性粒細胞可以通過CD16和CD193的表達差異來區(qū)分。
• 中性粒細胞是感染的第一反應者，通過吞噬作用和吞噬體中的酶降解來破壞病原體。

嗜酸性粒細胞：

• 嗜酸性粒細胞占白細胞的1-5%，具有雙葉核。
• 它們主要在血液循環(huán)或身體的脂肪組織中，保護身體免受寄生蟲感染。
• 嗜酸性粒細胞遷移到炎癥部位，并在寄生蟲感染時釋放含有麥芽糖結合蛋白（MBP）、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性粒細胞衍生神經(jīng)毒素（EDN）和促紅細胞生成素（EPO）的顆粒。
• 這些細胞毒性蛋白混合物可以對感染周圍的組織造成重大損害。
• 嗜酸性粒細胞可以通過CD193+來確認。

肥大細胞：

• 與嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞一樣，肥大細胞（MC）也對FcεRIa陽性，這是一種結合單體IgE的表面受體。
• 骨干標記中包含CD117有助于通過其CD123-/ CD117 hi來表型肥大細胞，與其他CD3-/CD14-亞群相比較。

總結
Conclusion

流式細胞術中的免疫監(jiān)測或免疫分析主要用于監(jiān)測人類外周血中細胞亞群和蛋白表達的變化，涉及多種免疫細胞的表面標記，包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和粒細胞等，以評估疾病進程或治療效果。