動態(tài)RNA甲基化修飾及其在哺乳動物發(fā)育和疾病中的調(diào)控作用
在已鑒定的170多種RNA核苷酸堿基的化學修飾中，RNA甲基化是存在于幾乎所有類型RNA上的的主要表觀轉(zhuǎn)錄修飾類型，并已被證明參與RNA代謝的整個過程，包括轉(zhuǎn)錄、 pre-mRNA可變剪切和成熟、mRNA出核、mRNA降解和穩(wěn)定、mRNA翻譯。由于高通量檢測技術(shù)發(fā)展以及動態(tài)調(diào)控因子和識別蛋白的鑒定，RNA甲基化修飾在調(diào)控生物體正常發(fā)育以及RNA甲基化失調(diào)時各種疾病發(fā)生和發(fā)育異常的機制已越來越清晰。中國科學院北京基因組研究所(國家生物信息中心)楊運桂研究員團隊以“Dynamic RNA methylation modifications and their regulatory role in mammalian development and diseases“為題發(fā)表綜述文章，特別關(guān)注三種RNA甲基化：N6-甲基胞嘧啶（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和N7-甲基腺苷（m7G），總結(jié)了這三種RNA修飾與其動態(tài)組裝和去除、特定結(jié)合蛋白以及高通量檢測技術(shù)發(fā)展相關(guān)元件。為全面理解其生物學意義，還概述了這三種mRNA甲基化修飾在配子發(fā)生、胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)發(fā)育以及疾病和腫瘤進展中的基本機制和關(guān)鍵作用的最新知識。
mRNA的分布特征和調(diào)控元件
m6A
m6A是研究最廣泛的RNA甲基化修飾類型，幾乎存在于所有類型的RNA中，包括染色質(zhì)相關(guān)新生pre-mRNA（chromatin-associated nascent pre-mRNA，caRNA）、成熟mRNA和非編碼RNA（ncRNA）。約25%哺乳動物細胞mRNA含有m6A，每個轉(zhuǎn)錄本平均含有三個m6A殘基。利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定出人類mRNA中m6A/A占比約0.4%–1.79%。m6A主要位于內(nèi)部mRNA中，特別是在靠近終止密碼子和mRNA的3′UTRs區(qū)域。m6A的保守motif序列是RRACH（R=A/G，H=A/C/U）。m6A的分布特征表明m6A可能廣泛參與mRNA代謝，如可變剪切、翻譯等，從而在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化形成由甲基轉(zhuǎn)移酶（“writers”）催化，主要由METTL3、METTL14和WTAP組成，以及其他蛋白亞基，包括ZC3H13/Hakai/Virilizer、KIAA1429（VIRMA）、RBM15/15B。METTL16也是METTL同源家族蛋白之一，催化MAT2A mRNA和U6 snRNA上的m6A形成。同時m6A甲基基團能夠被去甲基化酶（“erasers”）去除，主要包括FTO和ALKBH5家族成員。m6A修飾的RNA堿基位點被特定的結(jié)合蛋白（“readers”）識別以執(zhí)行多樣的生物學功能。迄今為止已鑒定的m6A readers包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDC1-2、YTHDF1-3）、核異質(zhì)核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPA2B1）、類胰島素生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白（IGF2BP1-3）、真核起始因子3（eIF3）（表1）。
m5C
m5C是另一種常見且豐富的RNA修飾，存在于各種RNA中，包括mRNA、tRNA、rRNA和vtRNA。在人類和小鼠的mRNA中，m5C位于翻譯起始位點（TSS）的下游區(qū)域，通過LC-MS/MS檢測人類mRNA中m5C/C占比約為0.02%–0.09%。
與m6A類似，m5C修飾也由其“writers”和“erasers”動態(tài)調(diào)控。已經(jīng)鑒定的幾個m5C甲基轉(zhuǎn)移酶（writers），包括NOL1/NOP2/SUN結(jié)構(gòu)域家族成員（NSUN1-7）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源物（DNMT2）和特異性tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員（TRDMT4A和TRDMT4B），其中NSUN2和NSUN6能夠催化mRNA上m5C形成。Tet家族蛋白（TET1和TET2）不僅催化DNA上5mC到5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的形成，還介導mRNA中m5C氧化。目前，有兩種主要類型的mRNA m5C readers蛋白，其具有特殊的RNA結(jié)合域，以決定m5C修飾RNA分子的不同命運，包括RNA和出口因子結(jié)合蛋白2（ALYREF）和Y-box結(jié)合蛋白（YBX1和YBX2）（表1）。
m7G
m7G也是一種普遍存在的RNA甲基化修飾，被發(fā)現(xiàn)位于真核生物的18S rRNA和tRNA變環(huán)以及microRNA（miRNA）中。此外，大多數(shù)真核mRNA在N7-鳥嘌呤的5′帽端含有m7G修飾。隨著靈敏度更高的檢測和定位技術(shù)發(fā)展，研究人員最近發(fā)現(xiàn)m7G修飾存在于mRNA內(nèi)部區(qū)域。在人類和小鼠細胞系的去帽poly(A)+ mRNA中，m7G/G占比約為0.02%–0.05%，占相同細胞中m6A/A的5%–10%（使用LC-MS/MS）。Zhang等人（2019b）報告稱，m7G峰值主要積聚區(qū)域位于3′UTR，次要區(qū)域在5′UTR內(nèi)部mRNA中。另一項報告也發(fā)現(xiàn)，人類和小鼠mRNA內(nèi)部的m7G修飾富集在5′UTR，特別是在翻譯起始位點附近的AG富集區(qū)域。
與m6A和m5C相比，關(guān)于m7G調(diào)控因子的研究才剛剛開始。報道的m7G甲基轉(zhuǎn)移酶包括Trm8p/Trm82p復合體和酵母中的Bud23/Trm112，以及哺乳動物中相應(yīng)的同源物METTL1/WDR4和WBSCR22/TRMT112，其中METTL1不僅介導tRNA上的m7G修飾，還催化mRNA內(nèi)部m7G修飾。此外，RNMT和RAM復合體參與催化哺乳動物N7-鳥嘌呤5′帽端的m7G修飾的形成。最新研究報告稱，QKI（QKI15、QKI16和QKI17）是mRNA內(nèi)部m7G修飾的第一個reader蛋白，它在應(yīng)激條件下與G3BP1互作，抑制m7G修飾的mRNA形成應(yīng)激顆粒，同時調(diào)控Hippo信號通路中關(guān)鍵基因的穩(wěn)定性和翻譯效率（表1）。
檢測技術(shù)
基于Bulk RNA甲基化檢測技術(shù)
基于免疫沉淀方法
抗體和免疫沉淀的RNA甲基化檢測策略，是一種簡單、穩(wěn)定且低成本的方法，傳統(tǒng)上被廣泛用于各種生物的表觀轉(zhuǎn)錄組特征圖譜繪制。典型的技術(shù)分為兩類：基于RNA甲基化抗體的（包括m6A/m5C/m7G-MeRIP-seq、m6A/m7G-miCLIP-seq、PA-m6A-seq和m6A-LAIC-seq）和基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的（m5C-miCLIP-Seq和AZA-IPseq）。
(1) MeRIP-seq
大多數(shù)用于RNA甲基化修飾的高通量測序技術(shù)依賴于特定甲基化抗體（如m6A、m5C和m7G）。甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq），如m6A-MeRIP-Seq（m6A-seq）（圖1A）、m5C-MeRIP-Seq（圖2A）和m7G-MeRIP-Seq（圖3A）是常用的方法，用于鑒定mRNA中的RNA甲基化peaks。然而，MeRIP-seq存在一些缺點，如相對較低的檢測分辨率（約100-150 nt）和對低豐度RNA上的RNA甲基化位點不敏感。Molinie等人（2016年）改進的m6A-MeRIP-seq開發(fā)了m6A-LAIC-seq（m6A水平和異構(gòu)體特征序列），通過調(diào)整抗體使用、涉及各種內(nèi)標調(diào)控和同時進行上清液（m6A陰性部分）的NGS測序，計算m6A陽性和m6A陰性部分的RNA表達，以在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量m6A的化學計量學（表2）。
(2) miCLIP-seq
通過將MeRIP技術(shù)與光交聯(lián)反應(yīng)結(jié)合，研究人員發(fā)明了UV誘導的抗體-RNA交聯(lián)方法來檢測轉(zhuǎn)錄組甲基化修飾，如PA-m6A-Seq（光交聯(lián)輔助m6A測序）（圖1C）、m6A-CLIP（m6A交聯(lián)免疫沉淀）（和m6A/m7G-miCLIP（m6A/m7G甲基化單堿基分辨率交聯(lián)免疫沉淀）（圖1B和3B）。m6A-CLIP和m6A/m7G-miCLIP均基于UV交聯(lián)RNA與m6A或m7G抗體在結(jié)合位點形成共價鍵，導致逆轉(zhuǎn)錄過程中的C-T位點轉(zhuǎn)換或截斷，通過此方法可以準確鑒定m6A位點并獲得單堿基分辨率甲基化圖譜（表2）。
(3) PA-m6A-seq
PA-m6A-seq（光交聯(lián)輔助m6A測序）方法依賴于4-硫尿苷（4SU，光敏感的核苷酸類似物）在細胞培養(yǎng)期間并入poly(A) RNA中，抗m6A免疫沉淀和UV交聯(lián)，隨后進行靶向RNA洗脫和文庫構(gòu)建（圖1C）。與MeRIP-Seq或m6A-seq相比，該方法實現(xiàn)哺乳動物接近單堿基分辨率全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜（表2）。
(4) m5C-miCLIP-seq
甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化體內(nèi)特定核酸堿基位點的RNA甲基化形成。m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2包含釋放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位點。m5C-miCLIP（m5C甲基化單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀）利用這一特性，通過結(jié)合細胞中外源表達的NSUN2-C271A（NSUN2上的突變釋放位點）與UV交聯(lián)免疫沉淀，其中突變蛋白NSUN2-C271A和m5C修飾位點在UV交聯(lián)下強烈結(jié)合形成共價鍵，這在RT-PCR過程中引起截斷或突變（圖2B）。因此，m5C-miCLIP也能夠以單堿基分辨率檢測m5C修飾位點（表2）。
(5) AZA-IP-seq
AZA-IP-seq（5-氮胞嘧啶介導的RNA免疫沉淀測序）是另一種基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的m5C檢測方法。簡要來說，5-氮胞嘧啶（5-azaC），作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑之一，可以隨機并入DNA和新生RNA中，并且也有能力與甲基轉(zhuǎn)移酶（外源和內(nèi)源）結(jié)合形成共價鍵。結(jié)合5-azaC處理和特定甲基轉(zhuǎn)移酶抗體（如NSUN2）的免疫沉淀，可以以單堿基分辨率檢測m5C修飾位點（圖2A，表2）。
表1：mRNA甲基化修飾調(diào)控因子綜述
基于化學反應(yīng)方法
(1) RNA-BisSeq
RNA亞硫酸鹽測序（RNA-BisSeq）是定量分析mRNA m5C甲基組的經(jīng)典方法之一。它依賴于用亞硫酸鹽預處理RNA，促使未修飾的C發(fā)生化學脫氨反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為U，而甲基化的胞嘧啶（m5C）保持為C。經(jīng)過RT、cDNA合成和PCR過程后，U堿基轉(zhuǎn)化為T，從而可以區(qū)分m5C和C。通過生物信息學分析，可以通過分析未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶來鑒定m5C修飾位點，同時，通過計算未轉(zhuǎn)化胞嘧啶的覆蓋率百分比來估計m5C甲基化水平（圖2D）。總的來說，RNA-BisSeq不需要在細胞中表達外源基因或化學試劑，能夠準確捕獲細胞和組織中原始的m5C修飾狀態(tài)。RNA-BisSeq被廣泛用于探索各種RNA中m5C的表達特征，并預測其潛在功能，包括哺乳動物、斑馬魚、擬南芥和水稻。RNA-BisSeq中m5C檢測的準確性取決于亞硫酸鹽處理過程中C到U的轉(zhuǎn)化效率，這受到反應(yīng)條件（如溫度、反應(yīng)時間）和RNA狀態(tài)（如RNA質(zhì)量、RNA二級結(jié)構(gòu)等）的影響（表2）。
(2)m6A-SEAL-seq
FTO輔助的m6A選擇性化學標記測序（m6A-SEAL-seq）是一種利用FTO作為催化劑將m6A轉(zhuǎn)化為hm6A（N6-羥甲基腺苷）的化學標記方法。不穩(wěn)定的hm6A將通過二硫蘇糖醇（DTT）介導的硫醇加成化學反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的dm6A（N6-二硫代肌醇甲腺苷）。然后，dm6A通過甲硫磺酸鹽（MTSEA）響應(yīng)組裝生物素標簽，隨后進行鏈霉親和純化和測序（圖1D）。m6A-SEAL分辨率約為200 nt（表2）。
(3) m6A-label-seq
這種技術(shù)基于甲硫氨酸類似物Se-烯丙基硒代同型半胱氨酸作為人類和小鼠細胞的培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)。這種類似物可以驅(qū)動甲基供體SAM被烯丙基團標記，通過細胞自身代謝形成Allyl-SAM或Allyl-SeAM。因此，細胞RNA能夠在假定m6A生成腺苷位點被代謝性地修飾為N6-烯丙基腺苷（a6A）。基于碘化誘導的a6A環(huán)化和在cDNA逆轉(zhuǎn)錄過程中對側(cè)位點錯配，實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率檢測。m6A-label-seq的建立為理解m6A在分子水平上的生理作用提供了強有力的工具，并且可以應(yīng)用于所有m6A motif。烯丙基團標記的效率和時間窗口對于準確鑒定m6A位點至關(guān)重要（表2）。
(4) m6A-SAC-seq
m6A選擇性烯丙基化學標記和測序（m6A-SAC-seq）是單堿基分辨率繪制全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜方法之一。這種方法的本質(zhì)是使用Dim1/KsgA家族的二甲基轉(zhuǎn)移酶酶（MjDim1）在m6A上添加烯丙基SAM化學基團形成烯丙基6m6A，隨后在I2處理后發(fā)生環(huán)化。環(huán)化的烯丙基6m6A在逆轉(zhuǎn)錄過程中將被read為突變。根據(jù)突變reads，可以定量和分析轉(zhuǎn)錄組中m6A沉積位點（圖1F）。m6A-SAC-seq能夠覆蓋幾乎所有經(jīng)典的m6A motif，并已應(yīng)用于檢測HeLa、HEK293、HepG2以及造血干細胞（HSC）和單核細胞中的m6A水平。m6A-SAC-seq的初始樣本量約為30ng的poly(A)或rRNA耗盡RNA（表2）。
(5) GLORI
類似于RNA m5C的RNA-BisSeq，乙二醛和亞硝酸鹽介導的未甲基化腺苷的脫氨（GLORI）也是一種無偏倚、絕對基于化學反應(yīng)的m6A定量方法。該程序包含三個連續(xù)步驟：①使用乙二醛形成可逆結(jié)構(gòu)保護G（N1, N2-二羥基鳥嘌呤加合物）以避免亞硝酸鹽誘導的G脫氨；②未甲基化的A通過亞硝酸鹽催化的脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化為I；③通過堿性或加熱條件處理實現(xiàn)G的脫保護（圖1G）。GLORI的主要優(yōu)勢是實現(xiàn)RNA中m6A定量分析，但GLORI成本高于m6A MeRIP-seq，且GLORI無法區(qū)分m6A和其他一些A修飾，如m6Am和m1A，盡管技術(shù)發(fā)明者聲稱已開發(fā)出分析流程來消除由m6Am和m1A引起的假陽性（表2）。
(6) eTAM-seq
進化的TadA輔助N6-甲基腺苷測序（eTAM-seq）是一種基于酶促脫氨反應(yīng)的單堿基分辨率m6A測序方法，用于全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量檢測m6A位點。簡要來說，使用高活性的tRNA腺苷脫氨酶TadA8.20進行脫氨反應(yīng)，全局未甲基化的A轉(zhuǎn)化為I，只能與C配對并在隨后的逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建和測序過程中被讀為G。修飾的m6A保持不變，在測序過程中仍然被讀為A。因此，通過eTAM-seq，A被讀為G，m6A被讀為A。eTAM-seq能夠在極少量RNA中（低至10個細胞的RNA）進行m6A的定量檢測，其初始RNA需求遠低于現(xiàn)有的m6A定量分析方法（圖1H）。
(7) TAWO-seq
TET輔助的過鎢酸鹽氧化測序（TAWO-seq）也是一種 RNA m5C單堿基分辨率測序方法，主要包含三個連續(xù)程序，包括由β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（βGT）標記保護的原始hm5C，由TET酶氧化的原始m5C轉(zhuǎn)化為hm5C，以及由過鎢酸鹽介導的新生成hm5C的選擇性氧化為三羥基胸腺嘧啶（thT）（圖2E）。這項技術(shù)的最大優(yōu)勢是與RNA-BisSeq相比能夠區(qū)分m5C和hm5C。
(8) m7G-seq
m7G上的正電荷對NaBH4介導的還原特別敏感。m7G-seq采用NaBH4介導的還原，在m7G位置上產(chǎn)生一個堿性位點，然后這些位點被生物素標記，隨后進行生物素下拉實驗。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，RNA中的生物素標記m7G位點會導致錯配（主要是T以及其他堿基），從而實現(xiàn)基于這些突變的m7G甲基組的單堿基分辨率（圖3C，表2）。
基于酶切反應(yīng)技術(shù)
MAZTER-seq和m6A-REF-seq（m6A敏感的RNA內(nèi)切核酸酶促進的測序）是同時報道不依賴抗體的方法，用于定量m6A的化學計量分析。這兩種方法都依賴于RNA內(nèi)切核酸酶MazF對ACA motif上的m6A識別，能夠在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測m6A修飾位點及其豐度。MazF在mRNA上更傾向于識別A-CA motif。由于RNA上m6A的motif是RRACH（R=A/G，H=A/C/U），大多數(shù)經(jīng)過MazF酶處理后的讀段將在5'端含有ACA，因此內(nèi)部的(m6A)CA基序被認定為甲基化位點（圖1I和J）。然而，這兩種方法都受限于內(nèi)切核酸酶對m6A CA序列的選擇性，這使得不包含m6A CA序列的序列無法被識別（表2）。
基于RNA編輯的技術(shù)
DART-seq（脫氨基作用鄰近RNA修飾靶標測序）是一種不依賴抗體的方法，通過在哺乳動物細胞中表達外源性的APOBEC1-YTH融合蛋白來檢測全局m6A修飾位點。其中，YTH（m6A結(jié)合域）識別m6A，而連接的APOBEC1（胞嘧啶脫氨酶）直接將胞嘧啶殘基上的C編輯為U。這些編輯位點在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中被識別為m6A修飾區(qū)域（圖1K）。由于YTH結(jié)構(gòu)域與m6A的2'-OH之間的氫鍵鍵合是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，DART-seq中的YTH結(jié)構(gòu)域無法識別m6Am。盡管DART-seq能夠從低量RNA（約10 ng總RNA）中繪制m6A位點，但需要將APOBEC1-YTH短暫轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞要求限制了其應(yīng)用，并且可能破壞了生理狀態(tài)（表2）。
圖1：mRNA甲基化測序技術(shù)的發(fā)展。過去十年m6A測序技術(shù)取得快速發(fā)展，在單堿基分辨率（約八種類型）和單細胞水平（約三種類型）上取得了突破：包括基于m6A抗體的（A）m6A-seq/MeRIP-seq、（B）miCLIP和（C）PA-m6A-seq；基于化學反應(yīng)的（D）m6A-SEAL-seq、（E）m6A-label-seq、（F）m6A-SPAC-seq和（G）GLORI、（H）eTAM-seq。
圖2：mRNA m5C甲基化測序技術(shù)�；诳贵wm5C檢測方法，包括基于甲基轉(zhuǎn)移酶或其融合標簽抗體的技術(shù)（A）AZA-seq和（B）m5C miCLIP-seq，以及基于m5C抗體的方法（C）m5C MeRIP-seq�；诨瘜W反應(yīng)的技術(shù)是（D）RNA-BisSeq和（E）TAWO-seq。
圖3：mRNA m7G甲基化測序技術(shù)。目前有三種流行的m7G檢測測序技術(shù)，包括（A）m7G MeRIP-seq和（B）基于m7G抗體富集的m7G-miCLIP-seq以及（C）基于化學反應(yīng)的m7G-seq。
與單細胞組學圖譜相比，傳統(tǒng)的群體細胞測序方法使用的樣本包含成千上萬個細胞，因此只能反映群體中的平均甲基化水平。特別是，細胞表達的異質(zhì)性在很大程度上被掩蓋，無法準確反映組織/器官的真實生理或病理特征。目前已經(jīng)建立單細胞水平的測序技術(shù)，用于繪制轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)開放可及性、DNA甲基化修飾等圖譜。報道的單細胞轉(zhuǎn)錄組甲基化圖譜技術(shù)包括scDART-seq和scm6A-seq。
(1) scDART-seq
scDART-seq是在引入10X Genomics單細胞測序后從DART-seq發(fā)展而來，是首個單細胞水平的m6A檢測方法。通過應(yīng)用scDART-seq，在成千上萬個單細胞中進行m6A圖譜分析，發(fā)現(xiàn)m6A在單細胞水平上表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，并且可以根據(jù)RNA甲基化特征區(qū)分細胞亞群，與基因表達水平無關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示以前在bulk-cell m6A分析中被忽視的m6A基本特征，并為理解m6A在不同細胞中的功能提供新見解（圖1L）。但由于scDART-seq基于外源基因表達，因此很難應(yīng)用于組織樣本，也無法呈現(xiàn)細胞的原始狀態(tài)（表2）。
(2) scm6A-seq
通過結(jié)合RNA多重標記和MeRIP-seq/m6A-IP，scm6A-seq能夠捕獲全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A圖譜，并能夠在不表達任何外源基因的情況下比較單細胞中的m6A水平。它已被用于區(qū)分有核仁包圍（SN）和無核仁包圍（NSN）的卵母細胞，以單細胞分辨率繪制小鼠卵母細胞發(fā)育和合子基因組激活期間的m6A調(diào)控機制（圖1M，表2）。
(3) picoMeRIP-seq
picoMeRIP-seq也是一種基于m6A抗體的低輸入RNA/細胞或單細胞啟動的m6A圖譜方法。與scm6A-seq相比，picoMeRIP-seq不標記單細胞中的RNA，后續(xù)文庫構(gòu)建直接使用商業(yè)的SMART-Seq stranded kit（TaKaRa）。在這種方法中，通過系統(tǒng)優(yōu)化關(guān)鍵步驟提高了m6A/A富集比率，包括增加洗滌劑（SDS）和鹽（NaCl）濃度，使用低結(jié)合管和商業(yè)m6A抗體（Millipore）等（圖1N）。picoMeRIP-seq已用于在100 pg poly(A) RNA、單個斑馬魚合子、單個小鼠卵母細胞和植入前胚胎、小鼠胚胎干細胞（1,000、100和10個細胞）的全轉(zhuǎn)錄組水平上繪制m6A（表2）。
綜上所述，過去十年中RNA甲基化測序技術(shù)的快速發(fā)展使我們能夠更清晰地了解RNA甲基化修飾的分布特征和功能機制。盡管每種技術(shù)都有其自身的優(yōu)勢和劣勢，但它們可以從多個維度進行補償或校正，以獲得更準確的RNA甲基化位點信息。此外，在單堿基精度和單細胞水平上取得了技術(shù)突破，這可以更精細地捕獲細胞間RNA甲基化的異質(zhì)性，并建立單細胞水平的RNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
生物學功能
RNA過程和代謝
作為轉(zhuǎn)錄后修飾，RNA甲基化參與RNA代謝的整個過程，如pre-mRNA剪切、mRNA出核、mRNA降解或穩(wěn)定性以及mRNA翻譯。
pre-mRNA剪切
pre-mRNA剪切作為基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的第一階段，是去除pre-mRNA中內(nèi)含子、有序連接外顯子以最終生成成熟mRNA的過程。pre-mRNA可變剪切是這一過程中的關(guān)鍵步驟，它可以從一個基因生成多個轉(zhuǎn)錄本，為遺傳多樣性和復雜性做出貢獻。m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5）和甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（WTAP、METTL3和METTL14）定位于核斑點中，提示m6A在RNA剪切中的潛在作用。FTO優(yōu)先結(jié)合內(nèi)含子區(qū)域pre-mRNA，靠近可變剪切（AS）外顯子和聚腺苷酸位點，并調(diào)控可變剪切和3′UTR表達。
m6A reader蛋白hnRNPG結(jié)合到共轉(zhuǎn)錄新生的m6A修飾pre-mRNA，并通過對RNA聚合酶II的互作及其在hnRNPG調(diào)控外顯子周圍的占位影響來調(diào)控可變剪切。此外，m6A分布在圍繞5′-和3′-剪切位點的外顯子區(qū)域，并與SRSF1和SRSF2的結(jié)合簇空間重疊。在3T3-L1細胞中敲除FTO增強了m6A水平，并促進了SRSF2蛋白的RNA結(jié)合能力，該蛋白調(diào)控脂肪生成調(diào)控因子RUNX1T1的可變剪切和隨后的前脂肪細胞分化。同時，有報道稱m6A參與依賴其閱讀蛋白YTHDC1的pre-mRNA剪切，促進pre-mRNA剪切因子SRSF3（SRp20）而阻止SRSF10（SRp38）進入目標mRNA的結(jié)合區(qū)域。小鼠卵母細胞中的Ythdc1與pre-mRNA 3′端處理因子（CPSF6、SRSF3和SRSF7）互作，并以m6A依賴方式廣泛參與可變聚腺苷酸化和改變3′UTR長度。果蠅中YTH家族蛋白的同源物YT521-B介導依賴于m6A的pre-mRNA可變剪切，并調(diào)控果蠅的神經(jīng)功能和性別決定。Louloupi等人報告稱，剪切位點上的m6A沉積促進快速剪切，而內(nèi)含子中高m6A水平與慢可變剪切相關(guān)。有趣的是，m6A開關(guān)調(diào)控HNRNPC結(jié)合活性，其中m6A主導RNA和reader蛋白互作的RNA結(jié)構(gòu)依賴性可及性，促進外顯子保守并影響目標mRNA的可變剪切�？偟膩碚f，m6A對pre-mRNA成熟過程發(fā)揮重要作用，但m5C或m7G是否也參與這一過程尚不清楚。
mRNA出核
mRNA出核是基因表達過程中的關(guān)鍵步驟，mRNA通過這一步驟被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中進行翻譯。大多數(shù)mRNA出核依賴于轉(zhuǎn)錄出核復合體（TREX）和核異二聚體出核受體（NXF1-P15）通路，其中TREX復合體成員被沉積在mRNA上并將其交給NXF1。
YTHDC1通過剪切因子SRSF3和出核接頭NXF1促進含m6A的mRNA出核。研究發(fā)現(xiàn)多個TREX亞基（ALYREF、UAP56、THOC5、CHTOP）與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（WTAP、METTL3、METTL14、KIAA1429）互作，調(diào)控轉(zhuǎn)錄本出核。Mettl3在細胞核中顯著增加了時鐘基因Per2和Arntl的mRNA積累，而細胞中ALKBH5缺失加速了mRNA的RNA出核。同時，HeLa細胞中YTHDC1缺失導致m6A修飾的mRNA核積聚，而在細胞質(zhì)中缺失。
除了m6A，m5C也在mRNA出核中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ALYREF不僅是m5C reader蛋白，也是調(diào)控核質(zhì)穿梭的TREX亞基之一。在HeLa細胞中，ALYREF促進含m5C的mRNA出核。3T3-L1細胞中NSUN2的缺乏導致ALYREF-m5C軸介導的CDKN1A mRNA出核減少，導致細胞周期加速和促進脂肪形成。
mRNA降解和穩(wěn)定性
m6A修飾參與調(diào)控mRNA代謝。在野生型mESCs中，Mettl3和Mettl14組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體在標靶轉(zhuǎn)錄本上催化m6A形成，隨后阻止與mRNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白HuR的結(jié)合，并增強microRNA靶點，導致目標轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定。YTHDF2是一個經(jīng)典的m6A reader蛋白，它通過多種通路促進含有m6A的靶轉(zhuǎn)錄本降解。首先，Wang等人（2014a）分析了YTHDF2蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)YTHDF2的羧基末端域（C-YTHDF2）選擇性地識別含m6A mRNA，而氨基末端域（N-YTHDF2）負責將YTHDF2-m6A-mRNA復合體定位到更專門的mRNA降解機器（如P體等）。其次，哺乳動物細胞中的YTHDF2招募CCR4-NOT脫腺苷酸酶復合體，加速含m6A RNA的脫腺苷酸化和降解。此外，YTHDF2還與HRSP12互作，招募RNase P/MRP復合體（內(nèi)切核糖核蛋白酶復合體），以切割含m6A的RNA。YTHDF2介導的m6A甲基化mRNA的降解在各種發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如維持造血干細胞功能、在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)生過程中母源mRNA降解、癌癥進展等。
與YTHDF2作用不同，另一個m6A reader蛋白IGF2BPs參與維持穩(wěn)定性和儲存，并在正常和應(yīng)激條件下影響目標m6A甲基化mRNA基因表達。IGF2BPs介導的m6A修飾mRNA的穩(wěn)定性參與腫瘤形成。
m5C修飾在mRNA穩(wěn)定性中也表現(xiàn)出類似的作用。兩項平行研究報告稱，m5C reader蛋白YBX1通過招募RNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白（HuR或PABPC1a）影響目標mRNA穩(wěn)定性，并因此參與膀胱尿路上皮癌（UCB）的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，以及斑馬魚胚胎發(fā)育。在小鼠Th17細胞中NSUN2缺失以m5C依賴方式導致Il17a和Il17f mRNAs的半衰期和數(shù)量減少。
翻譯
RNA甲基化已被證明可以促進或抑制翻譯過程。在細胞質(zhì)中，YTHDF1富集在40S核糖體的蛋白質(zhì)亞基中，并與翻譯啟動復合體的組成部分eIF3互作，從而促進m6A依賴的mRNA翻譯。
YTHDF3也與YTHDF1協(xié)同促進蛋白質(zhì)合成。另一項平行研究也報告稱，YTHDF3與YTHDF1合作，通過在翻譯過程中順序招募翻譯效應(yīng)物（40S和60S核糖體亞基）來促進m6A修飾目標mRNA的翻譯效率�？傮w而言，YTHDF1和YTHDF3通過與YTHDF1/YTHDF3鏈接，在轉(zhuǎn)錄本m6A修飾的3'端和40S和60S亞基的翻譯效應(yīng)物的5'端之間形成loop，調(diào)控翻譯啟動。最近的報告還說明了幾條分子通路參與YTHDF1或YTHDF3介導的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的翻譯過程。Zou等人（2023年）報告稱，YTHDF1與核糖體蛋白結(jié)合以促進其目標mRNA翻譯，但FMRP通過阻礙YTHDF1與核糖體蛋白的結(jié)合來抑制神經(jīng)翻譯。然而在神經(jīng)刺激下，F(xiàn)MRP被磷酸化并釋放YTHDF1，以提高m6A甲基化mRNA翻譯效率，從而促進神經(jīng)去極化。同時，Chen等人（2023年）已經(jīng)證明YTHDF1和YTHDF3（不是YTHDF2）攜帶高水平的營養(yǎng)感應(yīng)O-GlcNAc修飾，O-GlcNAcylation通過抑制它們與mRNA翻譯相關(guān)蛋白互作，抑制YTHDF1和YTHDF3的翻譯促進功能，導致m6A甲基化mRNA翻譯抑制。Chen等人（2023年）還建議不同的細胞在YTHDF1/3上表現(xiàn)出不同的O-GlcNAc修飾水平，這可能是先前研究對YTHDF1/3是否促進m6A RNA翻譯功能得出不同結(jié)論的原因之一。此外，當m6A位于5'UTR時，它可以通過被43S復合體組分eIF3識別，在細胞應(yīng)激下促進帽的單獨翻譯。另一個reader蛋白YTHDC2也以m6A依賴方式增強其靶標翻譯效率。盡管如此，Choi等人（2016年）證明，轉(zhuǎn)錄本中m6A修飾密碼子通過破壞轉(zhuǎn)錄本上tRNA的選擇導致翻譯延伸動態(tài)更慢和翻譯效率更低。此外，Lin等人（2016年）發(fā)現(xiàn)METTL3，而不依賴其m6A催化活性，通過招募eIF3到翻譯啟動復合體，增強包括重要的癌基因如EGFR和TAZ在內(nèi)的目標mRNA翻譯，導致人類肺癌細胞的生長、存活和侵襲得到促進。
m5C廣泛分布在rRNA和tRNA變區(qū)和反密碼loop上，通過調(diào)控tRNA穩(wěn)定性和密碼子識別、翻譯保真度和準確性或全局蛋白質(zhì)合成等參與翻譯調(diào)控。mRNA上的m5C也參與調(diào)控翻譯效率，在3T3-L1細胞中，NSUN2以m5C依賴的方式促進CDKN1A mRNA的翻譯效率。在大鼠的T淋巴細胞中，NSun2介導的m5C修飾在高同型半胱氨酸血癥誘導下促進IL-17A mRNA的翻譯。此外，NSUN6特異性m5C位點富集在3'UTR中的CTCCA motif上，與翻譯終止保真相關(guān)。然而，Tang等人（2015年）報告稱NSun2通過在p27 mRNA的5'UTR上的胞嘧啶C64上甲基化，抑制p27翻譯，表明mRNA上m5C位點可能決定其對翻譯效率的調(diào)控效應(yīng)。
真核mRNA的5'帽上m7G已被證明參與翻譯調(diào)控。最近的研究還表明，mRNA內(nèi)部的m7G修飾在mRNA翻譯通路中起作用。METTL1組裝的內(nèi)部m7G修飾能夠促進m7G修飾轉(zhuǎn)錄本翻譯效率，而不依賴于其對全局翻譯和tRNA甲基化的影響。內(nèi)部m7G在人類mRNA沿的表現(xiàn)顯示在翻譯起始位點保守富集，而在H2O2或熱休克處理下在CDS和3'UTR區(qū)域顯著積累，促進mRNA翻譯效率。此外，METTL1介導的m7G甲基化增強VEGFA mRNA翻譯，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的血管生成。
綜上所述，RNA甲基化修飾在包括pre-RNA處理、mRNA代謝和翻譯在內(nèi)的整個mRNA表達過程中發(fā)揮重要作用，凸顯其生物學意義。Li等人（2017c）證明METTL3/METTL14介導的m6A和NSUN2介導的m5C甲基化在p21 3'UTR中協(xié)同增強p21翻譯，在氧化應(yīng)激誘導的細胞衰老中導致p21表達升高，表明多種RNA甲基化修飾可能協(xié)同調(diào)控同一生物學事件。然而，仍然需要揭示這些修飾單獨或協(xié)同調(diào)控mRNA表達過程的更多調(diào)控機制，這將有助于描繪多種RNA甲基化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
哺乳動物發(fā)育
配子發(fā)生
一系列最新研究表明，RNA甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組在精子發(fā)生和卵子發(fā)生中扮演著至關(guān)重要的角色。Guo等人（2022年）通過LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，多種RNA修飾（如m5C、m3C、m7G、m2G、m22G、m1G和m1A）分布在人類精子的RNA中，這些修飾在弱精子癥（AZS）和畸精子癥（TZS）組中的水平顯著高于正常精子癥（NZS）組，特別是在TZS組中m5C和m6A的水平更高。在精子發(fā)生過程中，m6A作為一個重要的調(diào)控因子，參與哺乳動物精原細胞的有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成。Mettl3介導的m6A調(diào)控精原干細胞（SSCs）的增殖和分化，并影響減數(shù)分裂的啟動。在雄性生殖細胞中敲除METTL3或METTL14會導致睪丸組織中SSCs快速耗竭甚至完全缺失。人類精子中METTL3上調(diào)導致m6A水平增加，進而增強精子運動能力，這是弱精子癥的一個風險因素。此外，小鼠支持細胞特異性敲除Wtap會損害SSCs的自我更新和增殖能力，最終導致不育，通過干擾Wtap介導的m6A修飾基因的可變剪切。此外，ALKBH5介導的小鼠精原細胞和圓形精子細胞核中的m6A參與正確剪切和較長3'UTR mRNAs生成，這是精子發(fā)生的晚期減數(shù)分裂和單倍體階段所必需的。敲除FTO會導致GC-1精原細胞系的染色體不穩(wěn)定和G2/M階段轉(zhuǎn)換抑制。在小鼠中，Ythdc2在雄性或雌性生殖細胞中敲除導致異常的配子減數(shù)分裂，導致不育和睪丸及卵巢體積減小。同時，小鼠減數(shù)分裂細胞中條件性敲除Ythdc2導致轉(zhuǎn)錄組嚴重失調(diào)，包括編碼微管網(wǎng)絡(luò)蛋白的轉(zhuǎn)錄本，并導致減數(shù)分裂細胞和精原細胞在晚期減數(shù)分裂階段的端粒聚集和凋亡。成年雄性小鼠Ythdc1缺陷導致缺乏任何生殖細胞，包括有絲分裂精原細胞，并表現(xiàn)出僅支持細胞的表型。在小鼠精原細胞中敲除Ythdf2通過m6A/mRNA降解通路下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達，并影響細胞粘附和精原細胞增殖。此外，敲除m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2對精原干細胞和支持細胞沒有影響，但抑制了生殖細胞進入減數(shù)分裂的減數(shù)分裂階段。
在卵子發(fā)生過程中，METTL3介導的m6A通過促進母源mRNA翻譯效率對小鼠卵母細胞成熟是必需的。在卵母細胞的生殖泡（GV）階段敲低Mettl3嚴重抑制卵母細胞的減數(shù)分裂成熟。同時，Yao等人（2023年）證明METTL3催化的m6A沉積促進了GV期卵母細胞中m6A修飾RNA降解。然而，Mu等人（2021年）報告稱METTL3靶向Itsn2進行m6A修飾，隨后增強其在GV階段的穩(wěn)定性，以促進卵母細胞發(fā)育過程中減數(shù)分裂的恢復。此外，母源YTHDF2負責以m6A依賴方式指導適當?shù)哪冈崔D(zhuǎn)錄本劑量，從而決定哺乳動物卵母細胞質(zhì)量和雌性生育能力。卵母細胞中Ythdc1缺陷導致m6A依賴的可變剪切缺陷，導致卵母細胞成熟停滯和雌性不孕。在卵母細胞中特異性敲除KIAA1429導致GV期卵母細胞中m6A修飾RNA的異常代謝，導致GV卵母細胞無法進行生殖泡破裂（GVBD）和隨后失去恢復減數(shù)分裂能力。此外，卵巢中Nsun5缺失導致m5C在mRNA外顯子和3'UTR區(qū)域的時間依賴性下降，影響減數(shù)分裂阻滯缺陷2樣2（MAD2L2）的mRNA穩(wěn)定性、生長分化因子9（GDF9）的翻譯效率、以及Brd8外顯子區(qū)域的異�？勺兗羟�，導致卵泡發(fā)育和卵巢功能障礙。有趣的是，NSUN2在人類和小鼠MI/MII期卵母細胞的細胞質(zhì)中表達，可能促進NSUN2蛋白與母源mRNAs互作，并催化m5C形成。卵母細胞中m5C修飾轉(zhuǎn)錄本的逐漸增加和沉積可能在早期胚胎發(fā)生中起作用。
早期胚胎發(fā)育
RNA甲基化修飾在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在體外，小鼠GV期卵母細胞中METTL3缺失會阻礙受精后胚胎發(fā)育中的母系到合子轉(zhuǎn)變（MZT）和合子基因組激活，可能是通過破壞母源mRNA降解。小鼠胚胎4細胞階段的轉(zhuǎn)錄因子mRNA上，如Cdx2、Nanog、Sox2和Pou5f1的m6A修飾，可能參與調(diào)控合子基因激活（ZGA）過程。m6A reader蛋白YTHDF2在母源上是必需的，對于卵母細胞的能力和早期MZT過程，具有清除m6A修飾的母源mRNA作用。由METTL3依賴的m6A甲基化調(diào)控的HnRNPA2/B1在著床前胚胎發(fā)育期間在核和細胞質(zhì)中表達，其功能缺陷會延緩4細胞階段后的胚胎發(fā)育，并通過對胚泡中多能性的調(diào)控影響內(nèi)細胞團（ICM）的形成。斑馬魚胚胎發(fā)生中的m5C reader蛋白YBX1招募Pabpc1a來維持m5C修飾的母源mRNA穩(wěn)定性，促進有序的MZT過程。
對于小鼠胚胎干細胞（mESC），Wang等人報告稱m6A甲基化對于維持mESC在其基礎(chǔ)狀態(tài)至關(guān)重要，Mettl3或Mettl14缺失會導致mESC失去自我更新能力，這是由于HuR-microRNA和m6A介導的RNA穩(wěn)定性通路功能障礙。Zc3h13靶向核中的WTAP、Virilizer和Hakai的成分復合體上，催化m6A形成，然后促進mESC自我更新。Batista等人（2014年）證明小鼠和人類ESC中Mettl3缺失降低了m6A修飾水平，延長分化時Nanog表達，導致促進mESC自我更新和抑制mESC分化。此外，Mettl3介導的m6A甲基化維持多能性因子保真和及時下調(diào)，調(diào)控小鼠原始多能性解決過程中適當?shù)淖V系啟動和分化。Mettl14介導的m6A調(diào)控mRNA表達和可變剪切，并進一步轉(zhuǎn)換為原始多能性到啟動多能性和外胚層分化的小鼠胚胎。更重要的是，METTL14缺失在E6.5和E7.5（胚胎日）導致嚴重的生長遲緩和異常形態(tài)。
免疫系統(tǒng)發(fā)育
免疫細胞起源于造血干細胞（HSCs）分化，其命運對整個免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)支持RNA甲基化從多個角度調(diào)控HSCs。斑馬魚胚胎中Mettl3缺失抑制了最早的HSPCs生成，通過破壞YTHDF2介導的動脈內(nèi)皮基因 notch1a 和 rhoca 的m6A依賴性mRNA衰變。與斑馬魚中的功能一致，Mettl3-m6A-YTHDF2-Notch軸通路在小鼠HSPCs生成和明確的造血中也顯示出不可或缺和保守的功能。小鼠中階段特異性的Mettl3缺失導致HSCs積累，并因未能通過METTL3介導的m6A甲基化上調(diào)MYC表達而阻止HSC分化。Cheng等人（2019b）還證明m6A通過調(diào)控MYC mRNA穩(wěn)定性維持HSC對稱。同時METTL14在正常髓系造血過程中表達下調(diào)，并通過正向調(diào)控MYB和MYC mRNA穩(wěn)定性和翻譯，基于m6A方式促進HSPCs向髓系細胞分化。Ythdf2缺失通過促進與干細胞自我更新相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子m6A介導的mRNA穩(wěn)定性，促進HSPCs和人類臍帶血（hUCB）HSCs擴增。Mapperley等人（2021年）還報告稱，造血特異性Ythdf2缺失導致m6A修飾和炎癥反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，并激活促炎通路，導致淋巴潛能喪失，隨后髓系偏向和HSC擴增。并且老化的Ythdf2缺失HSCs導致多系造血重建失敗。
RNA甲基化通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本代謝參與先天免疫。在巨噬細胞中，SOCS1作為SOCS家族蛋白之一，參與巨噬細胞激活的負反饋回路，通過促進目標信號蛋白的多泛素化和蛋白酶體降解，以防止壓倒性的全身炎癥，其在巨噬細胞中對感染的響應(yīng)依賴于METTL14-m6A-YTHDF1軸。METTL3缺失導致m6A介導的mRNA穩(wěn)定性和Irakm高表達，最終抑制TLR（Toll樣受體）信號介導的巨噬細胞激活。樹突狀細胞（DCs）作為連接先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的專業(yè)抗原呈遞細胞（APCs），對啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)、消除入侵病原體和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Mettl3催化的mRNA m6A甲基化增強了CD40、CD80和TLR4信號接頭Tirap翻譯，并促進DC激活和TLR4/NF-κB信號誘導的細胞因子產(chǎn)生。此外，NK細胞中的Ythdf2對IL-15/STAT5信號介導的NK細胞存活、增殖和效應(yīng)功能是必需的，促進NK細胞的抗腫瘤和抗病毒免疫活性。小鼠腫瘤模型中Mettl3缺失下調(diào)m6A甲基化基因SHP-2表達，可能導致NK細胞對IL-15刺激應(yīng)答降低，并抑制NK細胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤和功能。
除了先天免疫，RNA甲基化還參與調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)。Mettl3介導SOCS家族蛋白SOCS1、SOCS3和CISH的m6A形成及其隨后的降解，降低了SOCS家族活性，從而促進IL-7介導的STAT5激活和naïve T細胞的穩(wěn)態(tài)增殖和分化。在Tregs中敲除Mettl3/m6A增加了Socs mRNA表達，從而抑制IL-2-STAT5信號通路，維持Tregs抑制功能。Th17細胞敲除METTL3可以促進SOCS3 mRNA穩(wěn)定性，從而抑制IL-17A和CCR5表達，破壞Th17細胞分化和浸潤。METTL3介導的m6A穩(wěn)定Tcf7轉(zhuǎn)錄本，允許正常產(chǎn)生TCF-1蛋白及其調(diào)控的T濾泡輔助（Tfh）細胞調(diào)控因子，促進了Tfh細胞分化、增殖和功能成熟。T細胞特異性敲除ALKBH5增強了CD4+ T細胞中m6A修飾水平，并下調(diào)Cxcl2和Ifng的mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達，導致CD4+ T細胞功能和中性粒細胞招募在自身免疫期間受到抑制。
與m6A相比，關(guān)于其他RNA甲基化修飾在免疫細胞中的功能機制的研究相對較少。在高同型半胱氨酸血癥（HHcy）誘導的大鼠慢性炎癥疾病模型中，NSun2通過催化m5C形成及其在T淋巴細胞中促進翻譯來介導IL-17A表達上調(diào)。Yang等人（2023年）還發(fā)現(xiàn)NSun2特別與Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子RoRγt結(jié)合，催化其靶標上的RNA m5C形成，包括Il17a和Il17f，從而增強其mRNA穩(wěn)定性。小鼠CD4+ T細胞中Nsun2缺失特別抑制了Th17細胞分化，并緩解Th17細胞誘導的結(jié)腸炎發(fā)病機制。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的CD4+ T細胞中，Nsun2表達和m5C修飾水平下調(diào)，高甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與mRNA剪切、穩(wěn)定和翻譯的細胞因子相關(guān)信號通路，而低甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與翻譯延伸。
總的來說，RNA甲基化修飾廣泛參與生物體的發(fā)育過程，并在配子發(fā)生、胚胎發(fā)生以及胚胎后神經(jīng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個功能通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，m6A在發(fā)育研究中的關(guān)注度比其他修飾更多。隨著檢測技術(shù)的進步和各種RNA甲基化調(diào)控因子的鑒定，其他甲基化修飾在發(fā)育中的功能分析也可能變得有價值。
癌癥
目前，已有數(shù)百項研究證明RNA甲基化通過直接作用或其調(diào)控元件參與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控。以下僅總結(jié)一些最新的（過去五年）和尖端的關(guān)于腫瘤發(fā)生中RNA甲基化修飾的研究。越來越多的證據(jù)表明m6A失調(diào)驅(qū)動異常的轉(zhuǎn)錄和翻譯程序，并隨后促進疾病或腫瘤的發(fā)生和進展，如白血病、肝細胞癌（HCC）、肺癌（LC）、結(jié)直腸癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌（BC）、胰腺癌（PC）、胃癌（GC）、膠質(zhì)母細胞瘤。m6A在癌細胞代謝中發(fā)揮重要作用，包括通過調(diào)控代謝相關(guān)通路，如mTOR、PTEN、MAPK、NF-κB、Wnt信號通路等，或轉(zhuǎn)錄因子，如HIF-1、FOXM1、cMyc、YAP。m6A還參與重塑各種腫瘤免疫，通過調(diào)控免疫細胞的生存或功能，包括B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、PD-1+ T細胞、Treg細胞、NK細胞、DC細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和CD4+記憶激活T細胞的浸潤，以及免疫相關(guān)細胞因子的表達，如FN-γ、CXCL9和CXCL10�？傮w而言，m6A影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移、代謝、免疫逃逸，在診斷和治療方面具有潛在價值。
m5C調(diào)控因子，如NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶和YBX1的reader蛋白，在腫瘤組織中高表達。m5Cs在腫瘤組織中也經(jīng)常出現(xiàn)高甲基化，并在致癌通路中富集。NSUN2和YBX1在UCB中靶向HDGF基因3'UTR的m5C，調(diào)控HDGF mRNA穩(wěn)定性并促進UCB發(fā)病機制。丙酮酸激酶肌肉同工酶M2（PKM2），作為一種限速的糖酵解酶，參與腫瘤代謝和生長，其mRNA的3'UTR含有m5C位點。ALYREF直接識別PKM2 mRNA并以其m5C依賴性方式促進其穩(wěn)定性，從而促進糖酵解和膀胱癌的腫瘤發(fā)生。類似的研究還表明，NSUN2介導的食管鱗狀細胞癌（ESCC）中的m5C高甲基化通過增強LIN28B依賴的GRB2 mRNA穩(wěn)定性，激活致癌的PI3K/AKT和ERK/MAPK信號，促進ESCC的起始和進展。NSUN2通過以m5C依賴方式上調(diào)TEAD1增強下咽鱗狀細胞癌（HPSCC）的增殖和侵襲。在HCC中，NSUN2介導的m5C修飾在HCC中明顯高于相鄰非癌組織。m5C通過抑制Ras通路活性并增加HCC細胞對索拉非尼的敏感性來調(diào)控HCC進展，并且m5C修飾的lncRNA H19招募G3BP1致癌蛋白促進HCC發(fā)生和發(fā)展。此外，蛋白質(zhì)翻譯后修飾通過修飾RNA甲基化reader蛋白參與調(diào)控m5C靶標，并影響腫瘤發(fā)生。SIAH1通過泛素化和降解YBX1間接促進m5C修飾RNA不穩(wěn)定性，抑制上皮卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移和藥物抗性。
幾項研究表明m7G tRNA修飾影響癌癥進展。METTL1/WDR4敲除破壞m7G tRNA解碼密碼子形成，降低mRNA翻譯效率并抑制肺癌、HCC、BC和鼻咽癌（NPC）進展。METTL1介導的HeLa細胞中mRNA內(nèi)部m7G也增強其靶標mRNA的翻譯效率，而不依賴其對全局翻譯和tRNA甲基化的影響。METTL1催化的人類臍靜脈內(nèi)皮細胞中VEGFA mRNA上的m7G組裝增加了VEGFA翻譯，并促進缺血后血管生成。這些研究表明內(nèi)部m7G可能參與癌癥進展。
總體而言，RNA甲基化修飾在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但不同修飾是否在腫瘤發(fā)生中協(xié)同或拮抗作用值得進一步研究。此外，盡管許多由RNA甲基化修飾調(diào)控的靶標和通路具有腫瘤診斷和治療的潛力，但實際應(yīng)用于臨床設(shè)置很少，需要進一步深入研究以促進臨床應(yīng)用。
結(jié)論與展望
本文總結(jié)了包括m6A、m5C和m7G在內(nèi)的三種甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控元件、分布特征、檢測技術(shù)以及生物學功能。由于RNA甲基化修飾在調(diào)控多種生理功能中的參與，主要概述了幾個熱點話題，包括配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)生、免疫系統(tǒng)發(fā)育和疾病。盡管m6A和m5C RNA修飾的調(diào)控元件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并廣泛研究，但關(guān)于其他RNA甲基化修飾的信息相對較少，特別是其erasers和readers需要確定。隨著對其他RNA甲基化修飾動態(tài)性質(zhì)的調(diào)控元件和機制的深入研究，對其功能機制的更清晰理解將有助于建立整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
盡管已經(jīng)開發(fā)了各種RNA甲基化修飾的測序技術(shù)，但它們中的大多數(shù)只能很好地捕獲和分析高豐度而不是低豐度轉(zhuǎn)錄本中的修飾信息，而后者將是一個有意義的突破點。此外，越來越多的研究表明RNA甲基化修飾參與多種生物過程和腫瘤發(fā)生。然而，幾乎所有的研究都是在群體細胞水平上進行的，這可能會忽視或扭曲單個細胞中的真實信息，限制對精確調(diào)控機制的理解，這對于指導疾病的精確靶向治療可能至關(guān)重要。因此，開發(fā)高通量單細胞RNA甲基化技術(shù)應(yīng)該是該領(lǐng)域的創(chuàng)新點和推動力。此外，幾項研究也表明多種RNA甲基化修飾可能共同調(diào)控某些生物過程。因此，探索不同RNA修飾之間的相互調(diào)控關(guān)系可能是未來的一個熱點話題，這對于構(gòu)建整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是必要的。目前能夠同時捕獲多種修飾的測序技術(shù)仍然相對較少，修飾類型的覆蓋范圍和靈敏度仍需改進。因此，開發(fā)新技術(shù)以同時檢測多種RNA表觀遺傳修飾是理解生物系統(tǒng)中整體作用模式的必要條件。
從文章的疾病部分來看，RNA表觀遺傳修飾及其調(diào)控因子在各種腫瘤的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。此外，多個RNA甲基化修飾基因或其通路已被報道作為診斷或治療的潛在靶標，但其目前的臨床應(yīng)用仍然非常有限。因此，需要加強特定RNA甲基化修飾抑制劑的研究，這可能是實現(xiàn)RNA甲基化修飾臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵點，盡管已有一些抑制劑的報道，如FTO抑制劑、Meclofenamic酸、FB23/FB23-2、MA2、Entacapone、DAC51、R-2HG、CS1/CS2、METTL3抑制劑（包括Compound 2/Compound 7）、STM2457、YTHDF2抑制劑（包括DC-Y13-27）和IGF2BP1抑制劑（包括BTYNB）。此外，幾項研究表明RNA甲基化修飾可以用于靶向編輯。在細胞水平上，表達與截短的METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域融合的核定位dCas13，與修飾的METTL3-METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶復合體和特定導向RNA融合的細胞質(zhì)定位，有能力在mRNA中將特定位點的腺苷修飾為m6A。Liu等人（2019b年）還設(shè)計了一個m6A動態(tài)編輯系統(tǒng)，將CRISPR-Cas9與單鏈m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3:METTL14融合以在特定位點編程m6A形成，同時將CRISPR-Cas9與ALKBH5或FTO融合以實現(xiàn)RNA的位點特異性去甲基化。然而，這些技術(shù)都是基于細胞內(nèi)編輯相關(guān)蛋白的表達，使得直接治療如人類腫瘤等疾病變得困難，而其他RNA甲基化的RNA編輯技術(shù)大多未知。此外，考慮到RNA甲基化修飾對mRNA代謝和翻譯有顯著影響，研究體外RNA甲基化靶向編輯技術(shù)對于增強mRNA藥物的效力具有重要意義。
總之，對RNA甲基化修飾的調(diào)控蛋白組分、測序技術(shù)、功能機制、抑制劑和靶向編輯技術(shù)的深入研究將提供關(guān)于RNA甲基化修飾在生物發(fā)育和疾病發(fā)生中功能角色的廣闊視野，對于疾病診斷和治療也具有寶貴的視角。
mRNA的分布特征和調(diào)控元件
m6A
m6A是研究最廣泛的RNA甲基化修飾類型，幾乎存在于所有類型的RNA中，包括染色質(zhì)相關(guān)新生pre-mRNA（chromatin-associated nascent pre-mRNA，caRNA）、成熟mRNA和非編碼RNA（ncRNA）。約25%哺乳動物細胞mRNA含有m6A，每個轉(zhuǎn)錄本平均含有三個m6A殘基。利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定出人類mRNA中m6A/A占比約0.4%–1.79%。m6A主要位于內(nèi)部mRNA中，特別是在靠近終止密碼子和mRNA的3′UTRs區(qū)域。m6A的保守motif序列是RRACH（R=A/G，H=A/C/U）。m6A的分布特征表明m6A可能廣泛參與mRNA代謝，如可變剪切、翻譯等，從而在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。m6A甲基化形成由甲基轉(zhuǎn)移酶（“writers”）催化，主要由METTL3、METTL14和WTAP組成，以及其他蛋白亞基，包括ZC3H13/Hakai/Virilizer、KIAA1429（VIRMA）、RBM15/15B。METTL16也是METTL同源家族蛋白之一，催化MAT2A mRNA和U6 snRNA上的m6A形成。同時m6A甲基基團能夠被去甲基化酶（“erasers”）去除，主要包括FTO和ALKBH5家族成員。m6A修飾的RNA堿基位點被特定的結(jié)合蛋白（“readers”）識別以執(zhí)行多樣的生物學功能。迄今為止已鑒定的m6A readers包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（YTHDC1-2、YTHDF1-3）、核異質(zhì)核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPA2B1）、類胰島素生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白（IGF2BP1-3）、真核起始因子3（eIF3）（表1）。
m5C
m5C是另一種常見且豐富的RNA修飾，存在于各種RNA中，包括mRNA、tRNA、rRNA和vtRNA。在人類和小鼠的mRNA中，m5C位于翻譯起始位點（TSS）的下游區(qū)域，通過LC-MS/MS檢測人類mRNA中m5C/C占比約為0.02%–0.09%。
與m6A類似，m5C修飾也由其“writers”和“erasers”動態(tài)調(diào)控。已經(jīng)鑒定的幾個m5C甲基轉(zhuǎn)移酶（writers），包括NOL1/NOP2/SUN結(jié)構(gòu)域家族成員（NSUN1-7）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶同源物（DNMT2）和特異性tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員（TRDMT4A和TRDMT4B），其中NSUN2和NSUN6能夠催化mRNA上m5C形成。Tet家族蛋白（TET1和TET2）不僅催化DNA上5mC到5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的形成，還介導mRNA中m5C氧化。目前，有兩種主要類型的mRNA m5C readers蛋白，其具有特殊的RNA結(jié)合域，以決定m5C修飾RNA分子的不同命運，包括RNA和出口因子結(jié)合蛋白2（ALYREF）和Y-box結(jié)合蛋白（YBX1和YBX2）（表1）。
m7G
m7G也是一種普遍存在的RNA甲基化修飾，被發(fā)現(xiàn)位于真核生物的18S rRNA和tRNA變環(huán)以及microRNA（miRNA）中。此外，大多數(shù)真核mRNA在N7-鳥嘌呤的5′帽端含有m7G修飾。隨著靈敏度更高的檢測和定位技術(shù)發(fā)展，研究人員最近發(fā)現(xiàn)m7G修飾存在于mRNA內(nèi)部區(qū)域。在人類和小鼠細胞系的去帽poly(A)+ mRNA中，m7G/G占比約為0.02%–0.05%，占相同細胞中m6A/A的5%–10%（使用LC-MS/MS）。Zhang等人（2019b）報告稱，m7G峰值主要積聚區(qū)域位于3′UTR，次要區(qū)域在5′UTR內(nèi)部mRNA中。另一項報告也發(fā)現(xiàn)，人類和小鼠mRNA內(nèi)部的m7G修飾富集在5′UTR，特別是在翻譯起始位點附近的AG富集區(qū)域。
與m6A和m5C相比，關(guān)于m7G調(diào)控因子的研究才剛剛開始。報道的m7G甲基轉(zhuǎn)移酶包括Trm8p/Trm82p復合體和酵母中的Bud23/Trm112，以及哺乳動物中相應(yīng)的同源物METTL1/WDR4和WBSCR22/TRMT112，其中METTL1不僅介導tRNA上的m7G修飾，還催化mRNA內(nèi)部m7G修飾。此外，RNMT和RAM復合體參與催化哺乳動物N7-鳥嘌呤5′帽端的m7G修飾的形成。最新研究報告稱，QKI（QKI15、QKI16和QKI17）是mRNA內(nèi)部m7G修飾的第一個reader蛋白，它在應(yīng)激條件下與G3BP1互作，抑制m7G修飾的mRNA形成應(yīng)激顆粒，同時調(diào)控Hippo信號通路中關(guān)鍵基因的穩(wěn)定性和翻譯效率（表1）。
檢測技術(shù)
基于Bulk RNA甲基化檢測技術(shù)
基于免疫沉淀方法
抗體和免疫沉淀的RNA甲基化檢測策略，是一種簡單、穩(wěn)定且低成本的方法，傳統(tǒng)上被廣泛用于各種生物的表觀轉(zhuǎn)錄組特征圖譜繪制。典型的技術(shù)分為兩類：基于RNA甲基化抗體的（包括m6A/m5C/m7G-MeRIP-seq、m6A/m7G-miCLIP-seq、PA-m6A-seq和m6A-LAIC-seq）和基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的（m5C-miCLIP-Seq和AZA-IPseq）。
(1) MeRIP-seq
大多數(shù)用于RNA甲基化修飾的高通量測序技術(shù)依賴于特定甲基化抗體（如m6A、m5C和m7G）。甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq），如m6A-MeRIP-Seq（m6A-seq）（圖1A）、m5C-MeRIP-Seq（圖2A）和m7G-MeRIP-Seq（圖3A）是常用的方法，用于鑒定mRNA中的RNA甲基化peaks。然而，MeRIP-seq存在一些缺點，如相對較低的檢測分辨率（約100-150 nt）和對低豐度RNA上的RNA甲基化位點不敏感。Molinie等人（2016年）改進的m6A-MeRIP-seq開發(fā)了m6A-LAIC-seq（m6A水平和異構(gòu)體特征序列），通過調(diào)整抗體使用、涉及各種內(nèi)標調(diào)控和同時進行上清液（m6A陰性部分）的NGS測序，計算m6A陽性和m6A陰性部分的RNA表達，以在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量m6A的化學計量學（表2）。
(2) miCLIP-seq
通過將MeRIP技術(shù)與光交聯(lián)反應(yīng)結(jié)合，研究人員發(fā)明了UV誘導的抗體-RNA交聯(lián)方法來檢測轉(zhuǎn)錄組甲基化修飾，如PA-m6A-Seq（光交聯(lián)輔助m6A測序）（圖1C）、m6A-CLIP（m6A交聯(lián)免疫沉淀）（和m6A/m7G-miCLIP（m6A/m7G甲基化單堿基分辨率交聯(lián)免疫沉淀）（圖1B和3B）。m6A-CLIP和m6A/m7G-miCLIP均基于UV交聯(lián)RNA與m6A或m7G抗體在結(jié)合位點形成共價鍵，導致逆轉(zhuǎn)錄過程中的C-T位點轉(zhuǎn)換或截斷，通過此方法可以準確鑒定m6A位點并獲得單堿基分辨率甲基化圖譜（表2）。
(3) PA-m6A-seq
PA-m6A-seq（光交聯(lián)輔助m6A測序）方法依賴于4-硫尿苷（4SU，光敏感的核苷酸類似物）在細胞培養(yǎng)期間并入poly(A) RNA中，抗m6A免疫沉淀和UV交聯(lián)，隨后進行靶向RNA洗脫和文庫構(gòu)建（圖1C）。與MeRIP-Seq或m6A-seq相比，該方法實現(xiàn)哺乳動物接近單堿基分辨率全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜（表2）。
(4) m5C-miCLIP-seq
甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化體內(nèi)特定核酸堿基位點的RNA甲基化形成。m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2包含釋放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位點。m5C-miCLIP（m5C甲基化單堿基分辨率交聯(lián)和免疫沉淀）利用這一特性，通過結(jié)合細胞中外源表達的NSUN2-C271A（NSUN2上的突變釋放位點）與UV交聯(lián)免疫沉淀，其中突變蛋白NSUN2-C271A和m5C修飾位點在UV交聯(lián)下強烈結(jié)合形成共價鍵，這在RT-PCR過程中引起截斷或突變（圖2B）。因此，m5C-miCLIP也能夠以單堿基分辨率檢測m5C修飾位點（表2）。
(5) AZA-IP-seq
AZA-IP-seq（5-氮胞嘧啶介導的RNA免疫沉淀測序）是另一種基于甲基轉(zhuǎn)移酶抗體的m5C檢測方法。簡要來說，5-氮胞嘧啶（5-azaC），作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑之一，可以隨機并入DNA和新生RNA中，并且也有能力與甲基轉(zhuǎn)移酶（外源和內(nèi)源）結(jié)合形成共價鍵。結(jié)合5-azaC處理和特定甲基轉(zhuǎn)移酶抗體（如NSUN2）的免疫沉淀，可以以單堿基分辨率檢測m5C修飾位點（圖2A，表2）。
表1：mRNA甲基化修飾調(diào)控因子綜述
基于化學反應(yīng)方法
(1) RNA-BisSeq
RNA亞硫酸鹽測序（RNA-BisSeq）是定量分析mRNA m5C甲基組的經(jīng)典方法之一。它依賴于用亞硫酸鹽預處理RNA，促使未修飾的C發(fā)生化學脫氨反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為U，而甲基化的胞嘧啶（m5C）保持為C。經(jīng)過RT、cDNA合成和PCR過程后，U堿基轉(zhuǎn)化為T，從而可以區(qū)分m5C和C。通過生物信息學分析，可以通過分析未轉(zhuǎn)化的胞嘧啶來鑒定m5C修飾位點，同時，通過計算未轉(zhuǎn)化胞嘧啶的覆蓋率百分比來估計m5C甲基化水平（圖2D）。總的來說，RNA-BisSeq不需要在細胞中表達外源基因或化學試劑，能夠準確捕獲細胞和組織中原始的m5C修飾狀態(tài)。RNA-BisSeq被廣泛用于探索各種RNA中m5C的表達特征，并預測其潛在功能，包括哺乳動物、斑馬魚、擬南芥和水稻。RNA-BisSeq中m5C檢測的準確性取決于亞硫酸鹽處理過程中C到U的轉(zhuǎn)化效率，這受到反應(yīng)條件（如溫度、反應(yīng)時間）和RNA狀態(tài)（如RNA質(zhì)量、RNA二級結(jié)構(gòu)等）的影響（表2）。
(2)m6A-SEAL-seq
FTO輔助的m6A選擇性化學標記測序（m6A-SEAL-seq）是一種利用FTO作為催化劑將m6A轉(zhuǎn)化為hm6A（N6-羥甲基腺苷）的化學標記方法。不穩(wěn)定的hm6A將通過二硫蘇糖醇（DTT）介導的硫醇加成化學反應(yīng)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的dm6A（N6-二硫代肌醇甲腺苷）。然后，dm6A通過甲硫磺酸鹽（MTSEA）響應(yīng)組裝生物素標簽，隨后進行鏈霉親和純化和測序（圖1D）。m6A-SEAL分辨率約為200 nt（表2）。
(3) m6A-label-seq
這種技術(shù)基于甲硫氨酸類似物Se-烯丙基硒代同型半胱氨酸作為人類和小鼠細胞的培養(yǎng)營養(yǎng)物質(zhì)。這種類似物可以驅(qū)動甲基供體SAM被烯丙基團標記，通過細胞自身代謝形成Allyl-SAM或Allyl-SeAM。因此，細胞RNA能夠在假定m6A生成腺苷位點被代謝性地修飾為N6-烯丙基腺苷（a6A）。基于碘化誘導的a6A環(huán)化和在cDNA逆轉(zhuǎn)錄過程中對側(cè)位點錯配，實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)單堿基分辨率檢測。m6A-label-seq的建立為理解m6A在分子水平上的生理作用提供了強有力的工具，并且可以應(yīng)用于所有m6A motif。烯丙基團標記的效率和時間窗口對于準確鑒定m6A位點至關(guān)重要（表2）。
(4) m6A-SAC-seq
m6A選擇性烯丙基化學標記和測序（m6A-SAC-seq）是單堿基分辨率繪制全轉(zhuǎn)錄組m6A圖譜方法之一。這種方法的本質(zhì)是使用Dim1/KsgA家族的二甲基轉(zhuǎn)移酶酶（MjDim1）在m6A上添加烯丙基SAM化學基團形成烯丙基6m6A，隨后在I2處理后發(fā)生環(huán)化。環(huán)化的烯丙基6m6A在逆轉(zhuǎn)錄過程中將被read為突變。根據(jù)突變reads，可以定量和分析轉(zhuǎn)錄組中m6A沉積位點（圖1F）。m6A-SAC-seq能夠覆蓋幾乎所有經(jīng)典的m6A motif，并已應(yīng)用于檢測HeLa、HEK293、HepG2以及造血干細胞（HSC）和單核細胞中的m6A水平。m6A-SAC-seq的初始樣本量約為30ng的poly(A)或rRNA耗盡RNA（表2）。
(5) GLORI
類似于RNA m5C的RNA-BisSeq，乙二醛和亞硝酸鹽介導的未甲基化腺苷的脫氨（GLORI）也是一種無偏倚、絕對基于化學反應(yīng)的m6A定量方法。該程序包含三個連續(xù)步驟：①使用乙二醛形成可逆結(jié)構(gòu)保護G（N1, N2-二羥基鳥嘌呤加合物）以避免亞硝酸鹽誘導的G脫氨；②未甲基化的A通過亞硝酸鹽催化的脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化為I；③通過堿性或加熱條件處理實現(xiàn)G的脫保護（圖1G）。GLORI的主要優(yōu)勢是實現(xiàn)RNA中m6A定量分析，但GLORI成本高于m6A MeRIP-seq，且GLORI無法區(qū)分m6A和其他一些A修飾，如m6Am和m1A，盡管技術(shù)發(fā)明者聲稱已開發(fā)出分析流程來消除由m6Am和m1A引起的假陽性（表2）。
(6) eTAM-seq
進化的TadA輔助N6-甲基腺苷測序（eTAM-seq）是一種基于酶促脫氨反應(yīng)的單堿基分辨率m6A測序方法，用于全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)定量檢測m6A位點。簡要來說，使用高活性的tRNA腺苷脫氨酶TadA8.20進行脫氨反應(yīng)，全局未甲基化的A轉(zhuǎn)化為I，只能與C配對并在隨后的逆轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建和測序過程中被讀為G。修飾的m6A保持不變，在測序過程中仍然被讀為A。因此，通過eTAM-seq，A被讀為G，m6A被讀為A。eTAM-seq能夠在極少量RNA中（低至10個細胞的RNA）進行m6A的定量檢測，其初始RNA需求遠低于現(xiàn)有的m6A定量分析方法（圖1H）。
(7) TAWO-seq
TET輔助的過鎢酸鹽氧化測序（TAWO-seq）也是一種 RNA m5C單堿基分辨率測序方法，主要包含三個連續(xù)程序，包括由β-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（βGT）標記保護的原始hm5C，由TET酶氧化的原始m5C轉(zhuǎn)化為hm5C，以及由過鎢酸鹽介導的新生成hm5C的選擇性氧化為三羥基胸腺嘧啶（thT）（圖2E）。這項技術(shù)的最大優(yōu)勢是與RNA-BisSeq相比能夠區(qū)分m5C和hm5C。
(8) m7G-seq
m7G上的正電荷對NaBH4介導的還原特別敏感。m7G-seq采用NaBH4介導的還原，在m7G位置上產(chǎn)生一個堿性位點，然后這些位點被生物素標記，隨后進行生物素下拉實驗。在逆轉(zhuǎn)錄過程中，RNA中的生物素標記m7G位點會導致錯配（主要是T以及其他堿基），從而實現(xiàn)基于這些突變的m7G甲基組的單堿基分辨率（圖3C，表2）。
基于酶切反應(yīng)技術(shù)
MAZTER-seq和m6A-REF-seq（m6A敏感的RNA內(nèi)切核酸酶促進的測序）是同時報道不依賴抗體的方法，用于定量m6A的化學計量分析。這兩種方法都依賴于RNA內(nèi)切核酸酶MazF對ACA motif上的m6A識別，能夠在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測m6A修飾位點及其豐度。MazF在mRNA上更傾向于識別A-CA motif。由于RNA上m6A的motif是RRACH（R=A/G，H=A/C/U），大多數(shù)經(jīng)過MazF酶處理后的讀段將在5'端含有ACA，因此內(nèi)部的(m6A)CA基序被認定為甲基化位點（圖1I和J）。然而，這兩種方法都受限于內(nèi)切核酸酶對m6A CA序列的選擇性，這使得不包含m6A CA序列的序列無法被識別（表2）。
基于RNA編輯的技術(shù)
DART-seq（脫氨基作用鄰近RNA修飾靶標測序）是一種不依賴抗體的方法，通過在哺乳動物細胞中表達外源性的APOBEC1-YTH融合蛋白來檢測全局m6A修飾位點。其中，YTH（m6A結(jié)合域）識別m6A，而連接的APOBEC1（胞嘧啶脫氨酶）直接將胞嘧啶殘基上的C編輯為U。這些編輯位點在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中被識別為m6A修飾區(qū)域（圖1K）。由于YTH結(jié)構(gòu)域與m6A的2'-OH之間的氫鍵鍵合是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，DART-seq中的YTH結(jié)構(gòu)域無法識別m6Am。盡管DART-seq能夠從低量RNA（約10 ng總RNA）中繪制m6A位點，但需要將APOBEC1-YTH短暫轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞要求限制了其應(yīng)用，并且可能破壞了生理狀態(tài)（表2）。
圖1：mRNA甲基化測序技術(shù)的發(fā)展。過去十年m6A測序技術(shù)取得快速發(fā)展，在單堿基分辨率（約八種類型）和單細胞水平（約三種類型）上取得了突破：包括基于m6A抗體的（A）m6A-seq/MeRIP-seq、（B）miCLIP和（C）PA-m6A-seq；基于化學反應(yīng)的（D）m6A-SEAL-seq、（E）m6A-label-seq、（F）m6A-SPAC-seq和（G）GLORI、（H）eTAM-seq。
圖2：mRNA m5C甲基化測序技術(shù)�；诳贵wm5C檢測方法，包括基于甲基轉(zhuǎn)移酶或其融合標簽抗體的技術(shù)（A）AZA-seq和（B）m5C miCLIP-seq，以及基于m5C抗體的方法（C）m5C MeRIP-seq�；诨瘜W反應(yīng)的技術(shù)是（D）RNA-BisSeq和（E）TAWO-seq。
表2：RNA甲基化檢測技術(shù)綜述
基于單細胞RNA甲基化檢測技術(shù)與單細胞組學圖譜相比，傳統(tǒng)的群體細胞測序方法使用的樣本包含成千上萬個細胞，因此只能反映群體中的平均甲基化水平。特別是，細胞表達的異質(zhì)性在很大程度上被掩蓋，無法準確反映組織/器官的真實生理或病理特征。目前已經(jīng)建立單細胞水平的測序技術(shù)，用于繪制轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)開放可及性、DNA甲基化修飾等圖譜。報道的單細胞轉(zhuǎn)錄組甲基化圖譜技術(shù)包括scDART-seq和scm6A-seq。
(1) scDART-seq
scDART-seq是在引入10X Genomics單細胞測序后從DART-seq發(fā)展而來，是首個單細胞水平的m6A檢測方法。通過應(yīng)用scDART-seq，在成千上萬個單細胞中進行m6A圖譜分析，發(fā)現(xiàn)m6A在單細胞水平上表現(xiàn)出高度異質(zhì)性，并且可以根據(jù)RNA甲基化特征區(qū)分細胞亞群，與基因表達水平無關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示以前在bulk-cell m6A分析中被忽視的m6A基本特征，并為理解m6A在不同細胞中的功能提供新見解（圖1L）。但由于scDART-seq基于外源基因表達，因此很難應(yīng)用于組織樣本，也無法呈現(xiàn)細胞的原始狀態(tài)（表2）。
(2) scm6A-seq
通過結(jié)合RNA多重標記和MeRIP-seq/m6A-IP，scm6A-seq能夠捕獲全轉(zhuǎn)錄組范圍的m6A圖譜，并能夠在不表達任何外源基因的情況下比較單細胞中的m6A水平。它已被用于區(qū)分有核仁包圍（SN）和無核仁包圍（NSN）的卵母細胞，以單細胞分辨率繪制小鼠卵母細胞發(fā)育和合子基因組激活期間的m6A調(diào)控機制（圖1M，表2）。
(3) picoMeRIP-seq
picoMeRIP-seq也是一種基于m6A抗體的低輸入RNA/細胞或單細胞啟動的m6A圖譜方法。與scm6A-seq相比，picoMeRIP-seq不標記單細胞中的RNA，后續(xù)文庫構(gòu)建直接使用商業(yè)的SMART-Seq stranded kit（TaKaRa）。在這種方法中，通過系統(tǒng)優(yōu)化關(guān)鍵步驟提高了m6A/A富集比率，包括增加洗滌劑（SDS）和鹽（NaCl）濃度，使用低結(jié)合管和商業(yè)m6A抗體（Millipore）等（圖1N）。picoMeRIP-seq已用于在100 pg poly(A) RNA、單個斑馬魚合子、單個小鼠卵母細胞和植入前胚胎、小鼠胚胎干細胞（1,000、100和10個細胞）的全轉(zhuǎn)錄組水平上繪制m6A（表2）。
綜上所述，過去十年中RNA甲基化測序技術(shù)的快速發(fā)展使我們能夠更清晰地了解RNA甲基化修飾的分布特征和功能機制。盡管每種技術(shù)都有其自身的優(yōu)勢和劣勢，但它們可以從多個維度進行補償或校正，以獲得更準確的RNA甲基化位點信息。此外，在單堿基精度和單細胞水平上取得了技術(shù)突破，這可以更精細地捕獲細胞間RNA甲基化的異質(zhì)性，并建立單細胞水平的RNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
生物學功能
RNA過程和代謝
作為轉(zhuǎn)錄后修飾，RNA甲基化參與RNA代謝的整個過程，如pre-mRNA剪切、mRNA出核、mRNA降解或穩(wěn)定性以及mRNA翻譯。
pre-mRNA剪切
pre-mRNA剪切作為基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的第一階段，是去除pre-mRNA中內(nèi)含子、有序連接外顯子以最終生成成熟mRNA的過程。pre-mRNA可變剪切是這一過程中的關(guān)鍵步驟，它可以從一個基因生成多個轉(zhuǎn)錄本，為遺傳多樣性和復雜性做出貢獻。m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5）和甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（WTAP、METTL3和METTL14）定位于核斑點中，提示m6A在RNA剪切中的潛在作用。FTO優(yōu)先結(jié)合內(nèi)含子區(qū)域pre-mRNA，靠近可變剪切（AS）外顯子和聚腺苷酸位點，并調(diào)控可變剪切和3′UTR表達。
m6A reader蛋白hnRNPG結(jié)合到共轉(zhuǎn)錄新生的m6A修飾pre-mRNA，并通過對RNA聚合酶II的互作及其在hnRNPG調(diào)控外顯子周圍的占位影響來調(diào)控可變剪切。此外，m6A分布在圍繞5′-和3′-剪切位點的外顯子區(qū)域，并與SRSF1和SRSF2的結(jié)合簇空間重疊。在3T3-L1細胞中敲除FTO增強了m6A水平，并促進了SRSF2蛋白的RNA結(jié)合能力，該蛋白調(diào)控脂肪生成調(diào)控因子RUNX1T1的可變剪切和隨后的前脂肪細胞分化。同時，有報道稱m6A參與依賴其閱讀蛋白YTHDC1的pre-mRNA剪切，促進pre-mRNA剪切因子SRSF3（SRp20）而阻止SRSF10（SRp38）進入目標mRNA的結(jié)合區(qū)域。小鼠卵母細胞中的Ythdc1與pre-mRNA 3′端處理因子（CPSF6、SRSF3和SRSF7）互作，并以m6A依賴方式廣泛參與可變聚腺苷酸化和改變3′UTR長度。果蠅中YTH家族蛋白的同源物YT521-B介導依賴于m6A的pre-mRNA可變剪切，并調(diào)控果蠅的神經(jīng)功能和性別決定。Louloupi等人報告稱，剪切位點上的m6A沉積促進快速剪切，而內(nèi)含子中高m6A水平與慢可變剪切相關(guān)。有趣的是，m6A開關(guān)調(diào)控HNRNPC結(jié)合活性，其中m6A主導RNA和reader蛋白互作的RNA結(jié)構(gòu)依賴性可及性，促進外顯子保守并影響目標mRNA的可變剪切�？偟膩碚f，m6A對pre-mRNA成熟過程發(fā)揮重要作用，但m5C或m7G是否也參與這一過程尚不清楚。
mRNA出核
mRNA出核是基因表達過程中的關(guān)鍵步驟，mRNA通過這一步驟被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中進行翻譯。大多數(shù)mRNA出核依賴于轉(zhuǎn)錄出核復合體（TREX）和核異二聚體出核受體（NXF1-P15）通路，其中TREX復合體成員被沉積在mRNA上并將其交給NXF1。
YTHDC1通過剪切因子SRSF3和出核接頭NXF1促進含m6A的mRNA出核。研究發(fā)現(xiàn)多個TREX亞基（ALYREF、UAP56、THOC5、CHTOP）與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（WTAP、METTL3、METTL14、KIAA1429）互作，調(diào)控轉(zhuǎn)錄本出核。Mettl3在細胞核中顯著增加了時鐘基因Per2和Arntl的mRNA積累，而細胞中ALKBH5缺失加速了mRNA的RNA出核。同時，HeLa細胞中YTHDC1缺失導致m6A修飾的mRNA核積聚，而在細胞質(zhì)中缺失。
除了m6A，m5C也在mRNA出核中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ALYREF不僅是m5C reader蛋白，也是調(diào)控核質(zhì)穿梭的TREX亞基之一。在HeLa細胞中，ALYREF促進含m5C的mRNA出核。3T3-L1細胞中NSUN2的缺乏導致ALYREF-m5C軸介導的CDKN1A mRNA出核減少，導致細胞周期加速和促進脂肪形成。
mRNA降解和穩(wěn)定性
m6A修飾參與調(diào)控mRNA代謝。在野生型mESCs中，Mettl3和Mettl14組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體在標靶轉(zhuǎn)錄本上催化m6A形成，隨后阻止與mRNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白HuR的結(jié)合，并增強microRNA靶點，導致目標轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定。YTHDF2是一個經(jīng)典的m6A reader蛋白，它通過多種通路促進含有m6A的靶轉(zhuǎn)錄本降解。首先，Wang等人（2014a）分析了YTHDF2蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)YTHDF2的羧基末端域（C-YTHDF2）選擇性地識別含m6A mRNA，而氨基末端域（N-YTHDF2）負責將YTHDF2-m6A-mRNA復合體定位到更專門的mRNA降解機器（如P體等）。其次，哺乳動物細胞中的YTHDF2招募CCR4-NOT脫腺苷酸酶復合體，加速含m6A RNA的脫腺苷酸化和降解。此外，YTHDF2還與HRSP12互作，招募RNase P/MRP復合體（內(nèi)切核糖核蛋白酶復合體），以切割含m6A的RNA。YTHDF2介導的m6A甲基化mRNA的降解在各種發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如維持造血干細胞功能、在卵母細胞成熟和胚胎發(fā)生過程中母源mRNA降解、癌癥進展等。
與YTHDF2作用不同，另一個m6A reader蛋白IGF2BPs參與維持穩(wěn)定性和儲存，并在正常和應(yīng)激條件下影響目標m6A甲基化mRNA基因表達。IGF2BPs介導的m6A修飾mRNA的穩(wěn)定性參與腫瘤形成。
m5C修飾在mRNA穩(wěn)定性中也表現(xiàn)出類似的作用。兩項平行研究報告稱，m5C reader蛋白YBX1通過招募RNA穩(wěn)定性相關(guān)蛋白（HuR或PABPC1a）影響目標mRNA穩(wěn)定性，并因此參與膀胱尿路上皮癌（UCB）的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移，以及斑馬魚胚胎發(fā)育。在小鼠Th17細胞中NSUN2缺失以m5C依賴方式導致Il17a和Il17f mRNAs的半衰期和數(shù)量減少。
翻譯
RNA甲基化已被證明可以促進或抑制翻譯過程。在細胞質(zhì)中，YTHDF1富集在40S核糖體的蛋白質(zhì)亞基中，并與翻譯啟動復合體的組成部分eIF3互作，從而促進m6A依賴的mRNA翻譯。
YTHDF3也與YTHDF1協(xié)同促進蛋白質(zhì)合成。另一項平行研究也報告稱，YTHDF3與YTHDF1合作，通過在翻譯過程中順序招募翻譯效應(yīng)物（40S和60S核糖體亞基）來促進m6A修飾目標mRNA的翻譯效率�？傮w而言，YTHDF1和YTHDF3通過與YTHDF1/YTHDF3鏈接，在轉(zhuǎn)錄本m6A修飾的3'端和40S和60S亞基的翻譯效應(yīng)物的5'端之間形成loop，調(diào)控翻譯啟動。最近的報告還說明了幾條分子通路參與YTHDF1或YTHDF3介導的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本的翻譯過程。Zou等人（2023年）報告稱，YTHDF1與核糖體蛋白結(jié)合以促進其目標mRNA翻譯，但FMRP通過阻礙YTHDF1與核糖體蛋白的結(jié)合來抑制神經(jīng)翻譯。然而在神經(jīng)刺激下，F(xiàn)MRP被磷酸化并釋放YTHDF1，以提高m6A甲基化mRNA翻譯效率，從而促進神經(jīng)去極化。同時，Chen等人（2023年）已經(jīng)證明YTHDF1和YTHDF3（不是YTHDF2）攜帶高水平的營養(yǎng)感應(yīng)O-GlcNAc修飾，O-GlcNAcylation通過抑制它們與mRNA翻譯相關(guān)蛋白互作，抑制YTHDF1和YTHDF3的翻譯促進功能，導致m6A甲基化mRNA翻譯抑制。Chen等人（2023年）還建議不同的細胞在YTHDF1/3上表現(xiàn)出不同的O-GlcNAc修飾水平，這可能是先前研究對YTHDF1/3是否促進m6A RNA翻譯功能得出不同結(jié)論的原因之一。此外，當m6A位于5'UTR時，它可以通過被43S復合體組分eIF3識別，在細胞應(yīng)激下促進帽的單獨翻譯。另一個reader蛋白YTHDC2也以m6A依賴方式增強其靶標翻譯效率。盡管如此，Choi等人（2016年）證明，轉(zhuǎn)錄本中m6A修飾密碼子通過破壞轉(zhuǎn)錄本上tRNA的選擇導致翻譯延伸動態(tài)更慢和翻譯效率更低。此外，Lin等人（2016年）發(fā)現(xiàn)METTL3，而不依賴其m6A催化活性，通過招募eIF3到翻譯啟動復合體，增強包括重要的癌基因如EGFR和TAZ在內(nèi)的目標mRNA翻譯，導致人類肺癌細胞的生長、存活和侵襲得到促進。
m5C廣泛分布在rRNA和tRNA變區(qū)和反密碼loop上，通過調(diào)控tRNA穩(wěn)定性和密碼子識別、翻譯保真度和準確性或全局蛋白質(zhì)合成等參與翻譯調(diào)控。mRNA上的m5C也參與調(diào)控翻譯效率，在3T3-L1細胞中，NSUN2以m5C依賴的方式促進CDKN1A mRNA的翻譯效率。在大鼠的T淋巴細胞中，NSun2介導的m5C修飾在高同型半胱氨酸血癥誘導下促進IL-17A mRNA的翻譯。此外，NSUN6特異性m5C位點富集在3'UTR中的CTCCA motif上，與翻譯終止保真相關(guān)。然而，Tang等人（2015年）報告稱NSun2通過在p27 mRNA的5'UTR上的胞嘧啶C64上甲基化，抑制p27翻譯，表明mRNA上m5C位點可能決定其對翻譯效率的調(diào)控效應(yīng)。
真核mRNA的5'帽上m7G已被證明參與翻譯調(diào)控。最近的研究還表明，mRNA內(nèi)部的m7G修飾在mRNA翻譯通路中起作用。METTL1組裝的內(nèi)部m7G修飾能夠促進m7G修飾轉(zhuǎn)錄本翻譯效率，而不依賴于其對全局翻譯和tRNA甲基化的影響。內(nèi)部m7G在人類mRNA沿的表現(xiàn)顯示在翻譯起始位點保守富集，而在H2O2或熱休克處理下在CDS和3'UTR區(qū)域顯著積累，促進mRNA翻譯效率。此外，METTL1介導的m7G甲基化增強VEGFA mRNA翻譯，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的血管生成。
綜上所述，RNA甲基化修飾在包括pre-RNA處理、mRNA代謝和翻譯在內(nèi)的整個mRNA表達過程中發(fā)揮重要作用，凸顯其生物學意義。Li等人（2017c）證明METTL3/METTL14介導的m6A和NSUN2介導的m5C甲基化在p21 3'UTR中協(xié)同增強p21翻譯，在氧化應(yīng)激誘導的細胞衰老中導致p21表達升高，表明多種RNA甲基化修飾可能協(xié)同調(diào)控同一生物學事件。然而，仍然需要揭示這些修飾單獨或協(xié)同調(diào)控mRNA表達過程的更多調(diào)控機制，這將有助于描繪多種RNA甲基化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
哺乳動物發(fā)育
配子發(fā)生
一系列最新研究表明，RNA甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組在精子發(fā)生和卵子發(fā)生中扮演著至關(guān)重要的角色。Guo等人（2022年）通過LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，多種RNA修飾（如m5C、m3C、m7G、m2G、m22G、m1G和m1A）分布在人類精子的RNA中，這些修飾在弱精子癥（AZS）和畸精子癥（TZS）組中的水平顯著高于正常精子癥（NZS）組，特別是在TZS組中m5C和m6A的水平更高。在精子發(fā)生過程中，m6A作為一個重要的調(diào)控因子，參與哺乳動物精原細胞的有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成。Mettl3介導的m6A調(diào)控精原干細胞（SSCs）的增殖和分化，并影響減數(shù)分裂的啟動。在雄性生殖細胞中敲除METTL3或METTL14會導致睪丸組織中SSCs快速耗竭甚至完全缺失。人類精子中METTL3上調(diào)導致m6A水平增加，進而增強精子運動能力，這是弱精子癥的一個風險因素。此外，小鼠支持細胞特異性敲除Wtap會損害SSCs的自我更新和增殖能力，最終導致不育，通過干擾Wtap介導的m6A修飾基因的可變剪切。此外，ALKBH5介導的小鼠精原細胞和圓形精子細胞核中的m6A參與正確剪切和較長3'UTR mRNAs生成，這是精子發(fā)生的晚期減數(shù)分裂和單倍體階段所必需的。敲除FTO會導致GC-1精原細胞系的染色體不穩(wěn)定和G2/M階段轉(zhuǎn)換抑制。在小鼠中，Ythdc2在雄性或雌性生殖細胞中敲除導致異常的配子減數(shù)分裂，導致不育和睪丸及卵巢體積減小。同時，小鼠減數(shù)分裂細胞中條件性敲除Ythdc2導致轉(zhuǎn)錄組嚴重失調(diào)，包括編碼微管網(wǎng)絡(luò)蛋白的轉(zhuǎn)錄本，并導致減數(shù)分裂細胞和精原細胞在晚期減數(shù)分裂階段的端粒聚集和凋亡。成年雄性小鼠Ythdc1缺陷導致缺乏任何生殖細胞，包括有絲分裂精原細胞，并表現(xiàn)出僅支持細胞的表型。在小鼠精原細胞中敲除Ythdf2通過m6A/mRNA降解通路下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達，并影響細胞粘附和精原細胞增殖。此外，敲除m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2對精原干細胞和支持細胞沒有影響，但抑制了生殖細胞進入減數(shù)分裂的減數(shù)分裂階段。
在卵子發(fā)生過程中，METTL3介導的m6A通過促進母源mRNA翻譯效率對小鼠卵母細胞成熟是必需的。在卵母細胞的生殖泡（GV）階段敲低Mettl3嚴重抑制卵母細胞的減數(shù)分裂成熟。同時，Yao等人（2023年）證明METTL3催化的m6A沉積促進了GV期卵母細胞中m6A修飾RNA降解。然而，Mu等人（2021年）報告稱METTL3靶向Itsn2進行m6A修飾，隨后增強其在GV階段的穩(wěn)定性，以促進卵母細胞發(fā)育過程中減數(shù)分裂的恢復。此外，母源YTHDF2負責以m6A依賴方式指導適當?shù)哪冈崔D(zhuǎn)錄本劑量，從而決定哺乳動物卵母細胞質(zhì)量和雌性生育能力。卵母細胞中Ythdc1缺陷導致m6A依賴的可變剪切缺陷，導致卵母細胞成熟停滯和雌性不孕。在卵母細胞中特異性敲除KIAA1429導致GV期卵母細胞中m6A修飾RNA的異常代謝，導致GV卵母細胞無法進行生殖泡破裂（GVBD）和隨后失去恢復減數(shù)分裂能力。此外，卵巢中Nsun5缺失導致m5C在mRNA外顯子和3'UTR區(qū)域的時間依賴性下降，影響減數(shù)分裂阻滯缺陷2樣2（MAD2L2）的mRNA穩(wěn)定性、生長分化因子9（GDF9）的翻譯效率、以及Brd8外顯子區(qū)域的異�？勺兗羟�，導致卵泡發(fā)育和卵巢功能障礙。有趣的是，NSUN2在人類和小鼠MI/MII期卵母細胞的細胞質(zhì)中表達，可能促進NSUN2蛋白與母源mRNAs互作，并催化m5C形成。卵母細胞中m5C修飾轉(zhuǎn)錄本的逐漸增加和沉積可能在早期胚胎發(fā)生中起作用。
早期胚胎發(fā)育
RNA甲基化修飾在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在體外，小鼠GV期卵母細胞中METTL3缺失會阻礙受精后胚胎發(fā)育中的母系到合子轉(zhuǎn)變（MZT）和合子基因組激活，可能是通過破壞母源mRNA降解。小鼠胚胎4細胞階段的轉(zhuǎn)錄因子mRNA上，如Cdx2、Nanog、Sox2和Pou5f1的m6A修飾，可能參與調(diào)控合子基因激活（ZGA）過程。m6A reader蛋白YTHDF2在母源上是必需的，對于卵母細胞的能力和早期MZT過程，具有清除m6A修飾的母源mRNA作用。由METTL3依賴的m6A甲基化調(diào)控的HnRNPA2/B1在著床前胚胎發(fā)育期間在核和細胞質(zhì)中表達，其功能缺陷會延緩4細胞階段后的胚胎發(fā)育，并通過對胚泡中多能性的調(diào)控影響內(nèi)細胞團（ICM）的形成。斑馬魚胚胎發(fā)生中的m5C reader蛋白YBX1招募Pabpc1a來維持m5C修飾的母源mRNA穩(wěn)定性，促進有序的MZT過程。
對于小鼠胚胎干細胞（mESC），Wang等人報告稱m6A甲基化對于維持mESC在其基礎(chǔ)狀態(tài)至關(guān)重要，Mettl3或Mettl14缺失會導致mESC失去自我更新能力，這是由于HuR-microRNA和m6A介導的RNA穩(wěn)定性通路功能障礙。Zc3h13靶向核中的WTAP、Virilizer和Hakai的成分復合體上，催化m6A形成，然后促進mESC自我更新。Batista等人（2014年）證明小鼠和人類ESC中Mettl3缺失降低了m6A修飾水平，延長分化時Nanog表達，導致促進mESC自我更新和抑制mESC分化。此外，Mettl3介導的m6A甲基化維持多能性因子保真和及時下調(diào)，調(diào)控小鼠原始多能性解決過程中適當?shù)淖V系啟動和分化。Mettl14介導的m6A調(diào)控mRNA表達和可變剪切，并進一步轉(zhuǎn)換為原始多能性到啟動多能性和外胚層分化的小鼠胚胎。更重要的是，METTL14缺失在E6.5和E7.5（胚胎日）導致嚴重的生長遲緩和異常形態(tài)。
免疫系統(tǒng)發(fā)育
免疫細胞起源于造血干細胞（HSCs）分化，其命運對整個免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)支持RNA甲基化從多個角度調(diào)控HSCs。斑馬魚胚胎中Mettl3缺失抑制了最早的HSPCs生成，通過破壞YTHDF2介導的動脈內(nèi)皮基因 notch1a 和 rhoca 的m6A依賴性mRNA衰變。與斑馬魚中的功能一致，Mettl3-m6A-YTHDF2-Notch軸通路在小鼠HSPCs生成和明確的造血中也顯示出不可或缺和保守的功能。小鼠中階段特異性的Mettl3缺失導致HSCs積累，并因未能通過METTL3介導的m6A甲基化上調(diào)MYC表達而阻止HSC分化。Cheng等人（2019b）還證明m6A通過調(diào)控MYC mRNA穩(wěn)定性維持HSC對稱。同時METTL14在正常髓系造血過程中表達下調(diào)，并通過正向調(diào)控MYB和MYC mRNA穩(wěn)定性和翻譯，基于m6A方式促進HSPCs向髓系細胞分化。Ythdf2缺失通過促進與干細胞自我更新相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子m6A介導的mRNA穩(wěn)定性，促進HSPCs和人類臍帶血（hUCB）HSCs擴增。Mapperley等人（2021年）還報告稱，造血特異性Ythdf2缺失導致m6A修飾和炎癥反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，并激活促炎通路，導致淋巴潛能喪失，隨后髓系偏向和HSC擴增。并且老化的Ythdf2缺失HSCs導致多系造血重建失敗。
RNA甲基化通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本代謝參與先天免疫。在巨噬細胞中，SOCS1作為SOCS家族蛋白之一，參與巨噬細胞激活的負反饋回路，通過促進目標信號蛋白的多泛素化和蛋白酶體降解，以防止壓倒性的全身炎癥，其在巨噬細胞中對感染的響應(yīng)依賴于METTL14-m6A-YTHDF1軸。METTL3缺失導致m6A介導的mRNA穩(wěn)定性和Irakm高表達，最終抑制TLR（Toll樣受體）信號介導的巨噬細胞激活。樹突狀細胞（DCs）作為連接先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的專業(yè)抗原呈遞細胞（APCs），對啟動適應(yīng)性免疫反應(yīng)、消除入侵病原體和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Mettl3催化的mRNA m6A甲基化增強了CD40、CD80和TLR4信號接頭Tirap翻譯，并促進DC激活和TLR4/NF-κB信號誘導的細胞因子產(chǎn)生。此外，NK細胞中的Ythdf2對IL-15/STAT5信號介導的NK細胞存活、增殖和效應(yīng)功能是必需的，促進NK細胞的抗腫瘤和抗病毒免疫活性。小鼠腫瘤模型中Mettl3缺失下調(diào)m6A甲基化基因SHP-2表達，可能導致NK細胞對IL-15刺激應(yīng)答降低，并抑制NK細胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤和功能。
除了先天免疫，RNA甲基化還參與調(diào)控適應(yīng)性免疫反應(yīng)。Mettl3介導SOCS家族蛋白SOCS1、SOCS3和CISH的m6A形成及其隨后的降解，降低了SOCS家族活性，從而促進IL-7介導的STAT5激活和naïve T細胞的穩(wěn)態(tài)增殖和分化。在Tregs中敲除Mettl3/m6A增加了Socs mRNA表達，從而抑制IL-2-STAT5信號通路，維持Tregs抑制功能。Th17細胞敲除METTL3可以促進SOCS3 mRNA穩(wěn)定性，從而抑制IL-17A和CCR5表達，破壞Th17細胞分化和浸潤。METTL3介導的m6A穩(wěn)定Tcf7轉(zhuǎn)錄本，允許正常產(chǎn)生TCF-1蛋白及其調(diào)控的T濾泡輔助（Tfh）細胞調(diào)控因子，促進了Tfh細胞分化、增殖和功能成熟。T細胞特異性敲除ALKBH5增強了CD4+ T細胞中m6A修飾水平，并下調(diào)Cxcl2和Ifng的mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達，導致CD4+ T細胞功能和中性粒細胞招募在自身免疫期間受到抑制。
與m6A相比，關(guān)于其他RNA甲基化修飾在免疫細胞中的功能機制的研究相對較少。在高同型半胱氨酸血癥（HHcy）誘導的大鼠慢性炎癥疾病模型中，NSun2通過催化m5C形成及其在T淋巴細胞中促進翻譯來介導IL-17A表達上調(diào)。Yang等人（2023年）還發(fā)現(xiàn)NSun2特別與Th17細胞轉(zhuǎn)錄因子RoRγt結(jié)合，催化其靶標上的RNA m5C形成，包括Il17a和Il17f，從而增強其mRNA穩(wěn)定性。小鼠CD4+ T細胞中Nsun2缺失特別抑制了Th17細胞分化，并緩解Th17細胞誘導的結(jié)腸炎發(fā)病機制。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的CD4+ T細胞中，Nsun2表達和m5C修飾水平下調(diào)，高甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與mRNA剪切、穩(wěn)定和翻譯的細胞因子相關(guān)信號通路，而低甲基化m5C轉(zhuǎn)錄本主要參與翻譯延伸。
總的來說，RNA甲基化修飾廣泛參與生物體的發(fā)育過程，并在配子發(fā)生、胚胎發(fā)生以及胚胎后神經(jīng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個功能通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，m6A在發(fā)育研究中的關(guān)注度比其他修飾更多。隨著檢測技術(shù)的進步和各種RNA甲基化調(diào)控因子的鑒定，其他甲基化修飾在發(fā)育中的功能分析也可能變得有價值。
癌癥
目前，已有數(shù)百項研究證明RNA甲基化通過直接作用或其調(diào)控元件參與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控。以下僅總結(jié)一些最新的（過去五年）和尖端的關(guān)于腫瘤發(fā)生中RNA甲基化修飾的研究。越來越多的證據(jù)表明m6A失調(diào)驅(qū)動異常的轉(zhuǎn)錄和翻譯程序，并隨后促進疾病或腫瘤的發(fā)生和進展，如白血病、肝細胞癌（HCC）、肺癌（LC）、結(jié)直腸癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌（BC）、胰腺癌（PC）、胃癌（GC）、膠質(zhì)母細胞瘤。m6A在癌細胞代謝中發(fā)揮重要作用，包括通過調(diào)控代謝相關(guān)通路，如mTOR、PTEN、MAPK、NF-κB、Wnt信號通路等，或轉(zhuǎn)錄因子，如HIF-1、FOXM1、cMyc、YAP。m6A還參與重塑各種腫瘤免疫，通過調(diào)控免疫細胞的生存或功能，包括B細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、PD-1+ T細胞、Treg細胞、NK細胞、DC細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和CD4+記憶激活T細胞的浸潤，以及免疫相關(guān)細胞因子的表達，如FN-γ、CXCL9和CXCL10�？傮w而言，m6A影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移、代謝、免疫逃逸，在診斷和治療方面具有潛在價值。
m5C調(diào)控因子，如NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶和YBX1的reader蛋白，在腫瘤組織中高表達。m5Cs在腫瘤組織中也經(jīng)常出現(xiàn)高甲基化，并在致癌通路中富集。NSUN2和YBX1在UCB中靶向HDGF基因3'UTR的m5C，調(diào)控HDGF mRNA穩(wěn)定性并促進UCB發(fā)病機制。丙酮酸激酶肌肉同工酶M2（PKM2），作為一種限速的糖酵解酶，參與腫瘤代謝和生長，其mRNA的3'UTR含有m5C位點。ALYREF直接識別PKM2 mRNA并以其m5C依賴性方式促進其穩(wěn)定性，從而促進糖酵解和膀胱癌的腫瘤發(fā)生。類似的研究還表明，NSUN2介導的食管鱗狀細胞癌（ESCC）中的m5C高甲基化通過增強LIN28B依賴的GRB2 mRNA穩(wěn)定性，激活致癌的PI3K/AKT和ERK/MAPK信號，促進ESCC的起始和進展。NSUN2通過以m5C依賴方式上調(diào)TEAD1增強下咽鱗狀細胞癌（HPSCC）的增殖和侵襲。在HCC中，NSUN2介導的m5C修飾在HCC中明顯高于相鄰非癌組織。m5C通過抑制Ras通路活性并增加HCC細胞對索拉非尼的敏感性來調(diào)控HCC進展，并且m5C修飾的lncRNA H19招募G3BP1致癌蛋白促進HCC發(fā)生和發(fā)展。此外，蛋白質(zhì)翻譯后修飾通過修飾RNA甲基化reader蛋白參與調(diào)控m5C靶標，并影響腫瘤發(fā)生。SIAH1通過泛素化和降解YBX1間接促進m5C修飾RNA不穩(wěn)定性，抑制上皮卵巢癌細胞的增殖、侵襲、遷移和藥物抗性。
幾項研究表明m7G tRNA修飾影響癌癥進展。METTL1/WDR4敲除破壞m7G tRNA解碼密碼子形成，降低mRNA翻譯效率并抑制肺癌、HCC、BC和鼻咽癌（NPC）進展。METTL1介導的HeLa細胞中mRNA內(nèi)部m7G也增強其靶標mRNA的翻譯效率，而不依賴其對全局翻譯和tRNA甲基化的影響。METTL1催化的人類臍靜脈內(nèi)皮細胞中VEGFA mRNA上的m7G組裝增加了VEGFA翻譯，并促進缺血后血管生成。這些研究表明內(nèi)部m7G可能參與癌癥進展。
總體而言，RNA甲基化修飾在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但不同修飾是否在腫瘤發(fā)生中協(xié)同或拮抗作用值得進一步研究。此外，盡管許多由RNA甲基化修飾調(diào)控的靶標和通路具有腫瘤診斷和治療的潛力，但實際應(yīng)用于臨床設(shè)置很少，需要進一步深入研究以促進臨床應(yīng)用。
結(jié)論與展望
本文總結(jié)了包括m6A、m5C和m7G在內(nèi)的三種甲基化表觀轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控元件、分布特征、檢測技術(shù)以及生物學功能。由于RNA甲基化修飾在調(diào)控多種生理功能中的參與，主要概述了幾個熱點話題，包括配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)生、免疫系統(tǒng)發(fā)育和疾病。盡管m6A和m5C RNA修飾的調(diào)控元件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并廣泛研究，但關(guān)于其他RNA甲基化修飾的信息相對較少，特別是其erasers和readers需要確定。隨著對其他RNA甲基化修飾動態(tài)性質(zhì)的調(diào)控元件和機制的深入研究，對其功能機制的更清晰理解將有助于建立整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
盡管已經(jīng)開發(fā)了各種RNA甲基化修飾的測序技術(shù)，但它們中的大多數(shù)只能很好地捕獲和分析高豐度而不是低豐度轉(zhuǎn)錄本中的修飾信息，而后者將是一個有意義的突破點。此外，越來越多的研究表明RNA甲基化修飾參與多種生物過程和腫瘤發(fā)生。然而，幾乎所有的研究都是在群體細胞水平上進行的，這可能會忽視或扭曲單個細胞中的真實信息，限制對精確調(diào)控機制的理解，這對于指導疾病的精確靶向治療可能至關(guān)重要。因此，開發(fā)高通量單細胞RNA甲基化技術(shù)應(yīng)該是該領(lǐng)域的創(chuàng)新點和推動力。此外，幾項研究也表明多種RNA甲基化修飾可能共同調(diào)控某些生物過程。因此，探索不同RNA修飾之間的相互調(diào)控關(guān)系可能是未來的一個熱點話題，這對于構(gòu)建整體RNA表觀遺傳修飾調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是必要的。目前能夠同時捕獲多種修飾的測序技術(shù)仍然相對較少，修飾類型的覆蓋范圍和靈敏度仍需改進。因此，開發(fā)新技術(shù)以同時檢測多種RNA表觀遺傳修飾是理解生物系統(tǒng)中整體作用模式的必要條件。
從文章的疾病部分來看，RNA表觀遺傳修飾及其調(diào)控因子在各種腫瘤的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。此外，多個RNA甲基化修飾基因或其通路已被報道作為診斷或治療的潛在靶標，但其目前的臨床應(yīng)用仍然非常有限。因此，需要加強特定RNA甲基化修飾抑制劑的研究，這可能是實現(xiàn)RNA甲基化修飾臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵點，盡管已有一些抑制劑的報道，如FTO抑制劑、Meclofenamic酸、FB23/FB23-2、MA2、Entacapone、DAC51、R-2HG、CS1/CS2、METTL3抑制劑（包括Compound 2/Compound 7）、STM2457、YTHDF2抑制劑（包括DC-Y13-27）和IGF2BP1抑制劑（包括BTYNB）。此外，幾項研究表明RNA甲基化修飾可以用于靶向編輯。在細胞水平上，表達與截短的METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域融合的核定位dCas13，與修飾的METTL3-METTL14甲基轉(zhuǎn)移酶復合體和特定導向RNA融合的細胞質(zhì)定位，有能力在mRNA中將特定位點的腺苷修飾為m6A。Liu等人（2019b年）還設(shè)計了一個m6A動態(tài)編輯系統(tǒng)，將CRISPR-Cas9與單鏈m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3:METTL14融合以在特定位點編程m6A形成，同時將CRISPR-Cas9與ALKBH5或FTO融合以實現(xiàn)RNA的位點特異性去甲基化。然而，這些技術(shù)都是基于細胞內(nèi)編輯相關(guān)蛋白的表達，使得直接治療如人類腫瘤等疾病變得困難，而其他RNA甲基化的RNA編輯技術(shù)大多未知。此外，考慮到RNA甲基化修飾對mRNA代謝和翻譯有顯著影響，研究體外RNA甲基化靶向編輯技術(shù)對于增強mRNA藥物的效力具有重要意義。
總之，對RNA甲基化修飾的調(diào)控蛋白組分、測序技術(shù)、功能機制、抑制劑和靶向編輯技術(shù)的深入研究將提供關(guān)于RNA甲基化修飾在生物發(fā)育和疾病發(fā)生中功能角色的廣闊視野，對于疾病診斷和治療也具有寶貴的視角。
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RNA甲基化
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