干細胞治療在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病中的應用優(yōu)勢及前景

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摘要：軸突退化、炎癥、神經(jīng)元死亡和細胞架構(gòu)扭曲可能導致中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷，如外傷、醫(yī)源性事件和神經(jīng)退行性疾病。由于缺乏前體細胞，成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力受到限制。干細胞自我更新和分化成多種細胞類型的能力為解決這些障礙以改善神經(jīng)再生提供了新的治療潛力。迄今為止，干細胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)再生中的潛在益處已受到關(guān)注。已有報道稱干細胞可治療缺血性腦損傷、周圍神經(jīng)損傷（PNI）和疼痛。干細胞可轉(zhuǎn)化為新的神經(jīng)元和其他支持細胞以改善神經(jīng)再生并恢復功能。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外，有效的再生還涉及神經(jīng)元與不同細胞外基質(zhì)支持細胞之間的聯(lián)系。要被視為臨床上有效的治療選擇，必須解決有限的供體來源、不可控的細胞成熟、低細胞存活率和低植入率等問題。本章提供了關(guān)于在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病中應用干細胞的研究綜述，主要是心臟驟停（CA）引起的全球性缺血性腦損傷和基于細胞的治療在PNI中的應用。本章描述了CA和PNI模型的建立，評估了使用不同類型的干細胞和輸送方法后增強的結(jié)果，介紹了用于進一步改善干細胞治療的技術(shù)，并為干細胞治療在神經(jīng)疾病中的前景提供了未來展望。

1.引言
神經(jīng)元或/和膠質(zhì)細胞的破壞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全腦缺血和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的周圍神經(jīng)損傷等常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首要病理機制。近年來，干細胞治療作為一種新穎的替代策略，有望在神經(jīng)損傷后恢復神經(jīng)功能。臨床前研究表明，干細胞移植通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和增強缺血性腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（NSCs）的神經(jīng)發(fā)生來改善神經(jīng)學結(jié)果。干細胞治療已被報道可減少神經(jīng)病理性疼痛，促進軸突再生和髓鞘再生，并最終增強神經(jīng)修復。幾項臨床研究表明干細胞在神經(jīng)損傷患者中的安全性和有效性。本章概述了干細胞治療在神經(jīng)損傷中的應用，包括心臟驟停（CA）引起的腦缺血損傷和PNI。我們首先簡要介紹CA和PNI后干細胞輸送方法和損傷模型，然后總結(jié)干細胞治療對CA和PNI的有益效果。

2. 心臟驟停引起的全腦缺血性腦損傷中的干細胞治療
心臟驟停引起的全腦缺血性腦損傷是危重病醫(yī)學中神經(jīng)功能障礙的主要原因。心臟驟停后的腦損傷由腦暴露于缺血時的原發(fā)性損傷和隨后再灌注期間的繼發(fā)性損傷組成。在美國，每年大約有380,000例院外心臟驟停病例和290,000例院內(nèi)心臟驟停病例。盡管神經(jīng)保護藥物和目標溫度管理取得了進展，許多幸存者仍在與持續(xù)的殘疾作斗爭。需要新的治療方法來替代受損的神經(jīng)元以恢復神經(jīng)功能。實現(xiàn)有效的腦復蘇以挽救缺血性神經(jīng)元和加速受損神經(jīng)組織的修復以改善腦功能恢復已成為全球挑戰(zhàn)。干細胞治療因其擴大修復效率和增強細胞分化的潛力而代表一種新的治療方法。干細胞移植通過包括神經(jīng)發(fā)生誘導、血管新生、細胞替代、軸突可塑性、髓鞘再生和神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)等潛在機制修復中風后的局灶性缺血性腦損傷。在中風患者中也報告了干細胞治療的治療效果。然而，全腦缺血性腦損傷中的干細胞治療報道較少。本節(jié)提供了在嚙齒動物CA模型中干細胞治療的概述，包括窒息CA模型、輸送途徑（腦內(nèi)室（ICV）和鼻內(nèi)給藥）以及干細胞治療后的神經(jīng)學結(jié)果。

2.1.心臟驟停和復蘇的實驗模型實驗性CA模型包括電極植入、插管、插管和窒息CA。在異氟醚麻醉下使用立體定向裝置植入螺釘電極。記錄電極的位置分別是Bregma側(cè)1.5毫米、尾端2.0毫米和側(cè)3.0毫米、尾端1.5毫米。為了最小化噪聲，一個參考電極被放置在Bregma側(cè)1.5毫米、尾端1.4毫米。所有電極僅與硬腦膜輕輕接觸，并未穿透腦實質(zhì)。在CA當天，麻醉動物被保持仰臥位，并使用14號氣管插管在喉鏡下插管至預定長度。氣管插管通過縫合固定在臉頰上，以防止移位和滑脫。混合氧、氮和異氟醚的呼吸機支持大鼠。使用股動脈導管監(jiān)測平均血壓（MAP）并收集血液進行動脈血氣（ABG）測試。在窒息CA前通過靜脈給予維庫溴銨使大鼠癱瘓。通過關(guān)閉呼吸機和夾住氣管插管來誘導全腦窒息。MAP <10 mmHg、無脈動壓力波或心電靜止活動被定義為CA。通過解開氣管插管、重新啟動呼吸機、通過股靜脈給予腎上腺素和碳酸氫鈉以及持續(xù)的心肺復蘇（CPR）來開始復蘇。通過使MAP >60 mmHg，實現(xiàn)了自主循環(huán)恢復（ROSC）。根據(jù)ABG結(jié)果，相應調(diào)整呼吸參數(shù)，如呼吸頻率、潮氣量和/或正壓呼氣末壓力（PEEP），以保持PCO2在35至45 mmHg之間。連續(xù)監(jiān)測腦電圖（EEG）、心電圖（ECG）、血壓和溫度。使用加熱墊將溫度控制在36.5-37.5°C。

2.2.心臟驟停后干細胞治療的輸送方法輸送干細胞的途徑包括靜脈注射（IV）、動脈內(nèi)注射（IA）、腦室內(nèi)（ICV）給藥、鼻內(nèi)給藥、顱內(nèi)（IC）注射和腹腔內(nèi)（IP）給藥。通過IV給藥將干細胞輸送到大腦的能力是有限的，一些細胞會積聚在外圍器官，如肺、肝、脾和腎臟。在人類中，通過靜脈注射的脂肪組織源干細胞治療中已有肺栓塞的報道。通過IA給藥繞過系統(tǒng)組織的攝取，以避免肺栓塞的風險。然而，當細胞在腦動脈中聚集時，可能導致腦缺血。通過IP途徑給藥的干細胞會被困在腹腔內(nèi)，只有部分穿透大腦。IC給藥能夠在目標區(qū)域?qū)崿F(xiàn)更高的細胞濃度。然而，由于其侵入性，可能會引起局部腦損傷。ICV給藥通過腦脊液（CSF）擴散將干細胞輸送到多個部位。鼻內(nèi)給藥是一種非侵入性方法，能夠穿過血腦屏障（BBB）。在確定干細胞治療的最佳輸送技術(shù)時，必須考慮幾個標準，包括實際可操作性、足夠的BBB穿透、輸送速度和特定靶向。本節(jié)討論了心臟驟停后ICV和鼻內(nèi)輸送干細胞治療的實驗方法。

2.2.1.心臟驟停后腦室內(nèi)注射干細胞復蘇后3小時，大鼠被放置在異氟醚麻醉下的立體定向裝置中。通過1-1.5厘米的皮膚切口使頭骨可見。使用高速鉆頭，在Bregma側(cè)1.5毫米、尾端1.2毫米處鉆ICV孔，深度為4毫米。干細胞被緩慢且連續(xù)地注入側(cè)腦室，超過一分鐘。針頭至少保留一分鐘以防止干細胞泄漏。然后逐漸拔出針頭。

2.2.2.心臟驟停后鼻內(nèi)給藥干細胞ROSC后3小時，通過每個鼻孔的滴管尖端給藥干細胞，以提高滲透性并促進細胞進入大腦。干細胞在右鼻孔和左鼻孔各注入兩次，每次給藥間隔10分鐘。每次給每個鼻孔注入10μl，直到總共注入40μl干細胞。

2.3.心臟驟停后干細胞治療的神經(jīng)學評估持續(xù)的氧氣和能量底物供應對大腦組織的健康至關(guān)重要，當腦血流中斷時，大腦的功能就會受損。這部分總結(jié)了多種評估心臟驟停引起的缺血性腦損傷后干細胞給藥神經(jīng)恢復的方法。包括定量電生理分析的定量腦電圖（qEEG）和體感誘發(fā)電位（SSEP）、神經(jīng)功能缺損評分（NDS）和組織病理學檢查在內(nèi)的經(jīng)過充分驗證的系統(tǒng)評估被介紹。重點介紹了ICV和鼻內(nèi)輸送策略的治療效果。動脈血氣（ABG）結(jié)果基線時和ROSC后20分鐘通過股動脈評估ABG測試，最多取0.05-0.1毫升血樣。所有呼吸機設(shè)置根據(jù)復蘇后的ABG結(jié)果相應調(diào)整。神經(jīng)功能缺損評分和存活率臨床檢查、神經(jīng)影像學和電生理測試是主要的神經(jīng)生理預后措施。包括腦干反射在內(nèi)的臨床檢查已整合到經(jīng)過充分驗證的NDS檢查中，用于評估心臟驟停后的整體神經(jīng)行為功能（圖1）。NDS檢查基于以下標準分配了80分的總分：整體行為功能障礙、腦干功能、運動和感覺評估、運動行為、簡單行為反應和癲癇發(fā)作。高級運動功能范圍為0至18。它使用子NDS分析進行評估，包括走平衡木、步態(tài)協(xié)調(diào)、翻正反射、負地理定位、視覺放置和轉(zhuǎn)彎巷測試。在ROSC后6小時、24小時、48小時和72小時等多個時間點測試了聚合NDS和子NDS。記錄了過早死亡動物的存活時間，并使用Kaplan-Meier分析分析了72小時存活率。

圖 1 神經(jīng)功能缺損評分（NDS）。NDS持續(xù)時間<60被定義為嚴重神經(jīng)功能缺損（SND）的閾值。* 高級運動功能的子NDS電生理評估包括正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、磁共振成像（MRI）和計算機斷層掃描（CT）在內(nèi)的成像技術(shù)的進步，使得建立新的成像標志以預測心臟驟停后患者神經(jīng)障礙的長期恢復成為可能。由于它們有限的分辨率和對實時信息獲取的限制，迫切需要開發(fā)非侵入性技術(shù)以改善心臟驟停后功能結(jié)果預測。改進的電生理監(jiān)測，重點關(guān)注腦電圖和SSEP，可以幫助以更高的靈敏度和特異性評估整體神經(jīng)功能損害的嚴重程度，并且可以方便地在床邊進行。Jia的研究小組已經(jīng)研究了多模態(tài)預后指標的有效性。腦電圖是通過一系列電極獲得的大腦電活動的記錄。在CA前，腦電圖被記錄為5分鐘的基線生理測量，并且在ROSC后的前6小時恢復期間進行了連續(xù)記錄。定量腦電圖描述了腦電圖在一段時間內(nèi)的數(shù)學屬性。信息量化（IQ）是腦電圖信號的一種新的定量測量方法，腦電圖-IQ已被充分驗證為預測心臟驟停后神經(jīng)結(jié)果的良好指標。所有腦電圖數(shù)據(jù)都被分析并以腦電圖-IQ的定量形式導出，使用MATLAB的核心算法。所有數(shù)據(jù)都標準化到基線。在CA時腦電圖波形幾乎變平，腦電圖-IQ值幾乎降至零。隨后，腦電圖信號和腦電圖-IQ值在復蘇后逐漸恢復。SSEP對皮質(zhì)和皮質(zhì)下缺血敏感，并且比腦電圖受鎮(zhèn)靜或低溫的影響較小。在CA之后，SSEP能更好地識別預后不佳的患者，而不是預測良好結(jié)果。作為心臟驟停后預后不良的最準確的神經(jīng)生理預測因子，SSEP已被Jia和其他研究小組廣泛研究，以評估復蘇后的神經(jīng)結(jié)果。在臨床前研究中，評估定量SSEP信號的新技術(shù)顯示出預測CA后良好神經(jīng)結(jié)果的希望。定量SSEP可以幫助確定治療目標，并預測大腦在復蘇后將如何恢復。除了當前臨床治療標準中的N20峰值缺失/存在之外，SSEP是無意識心臟驟�；颊哳A后良好的最早預測因子之一。在心臟驟停引起的缺血性腦損傷后，SSEP中特征峰值的延長潛伏期和振幅降低表明了受損的神經(jīng)傳導性。組織病理學評估甲苯胺藍染色用于識別海馬CA后缺血性損傷的神經(jīng)元。組織病理學損傷評分（HDS），定義為目標區(qū)域死亡或缺血性神經(jīng)元的比例，被引入作為評估神經(jīng)元損傷的定量指標。采用不同方法追蹤移植的干細胞。PKH26，一種紅色熒光染料，被選作預標記移植的NSCs作為特定的細胞追蹤器。PKH26陽性NSCs主要分布在海馬CA1和大腦皮層區(qū)域，28天后通過ICV遞送途徑的CA。其他研究使用人類核Ku-86來識別移植的人類NSCs的遷移。NSCs腦室內(nèi)注射后72小時，Ku-86陽性細胞遷移并在CA大鼠的海馬區(qū)域主要發(fā)現(xiàn)。內(nèi)源性NSCs在齒狀回（DG）和側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）區(qū)域豐富，可以在外來NSC治療后被誘導增殖和遷移。鑒于SVZ和腦室接近，ICV給藥可能更有效地激活SVZ細胞。因此，也評估了SVZ內(nèi)源性NSCs增殖和遷移以增強神經(jīng)發(fā)生的能力。

2.3.1.用腦室內(nèi)注射干細胞治療CA誘導的缺血性腦損傷基線ABG結(jié)果和電生理評估CA前不同組大鼠的基線條件是可比的，包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基礎(chǔ)過量和SO2）和器官灌注（乳酸）在內(nèi)的基線ABG結(jié)果沒有顯著差異。電生理EEG-IQ評估顯示，干細胞治療組和非治療組在ROSC后3小時內(nèi)的EEG-IQ值相似，表明通過ICV給藥的干細胞治療前EEG所指示的神經(jīng)恢復是相同的。神經(jīng)功能缺損評分和存活率NDS評估顯示，通過腦室內(nèi)注射NSCs的干細胞治療顯著改善了CA后缺血性腦損傷的神經(jīng)結(jié)果，表現(xiàn)為ROSC后NDS隨時間逐漸增加，干細胞治療組的NDS表現(xiàn)更好。ROSC后3小時ICV遞送NSCs增強了神經(jīng)功能的恢復，如更好的聚合NDS所示以及在ROSC后48小時和72小時的運動功能和行為的子NDS。Kaplan-Meier分析還顯示了存活率的有利結(jié)果。ICV移植NSCs提高了CA后全腦缺血的存活率。組織病理學評估組織病理學評估顯示，無論是NSC治療組還是僅CA組，在CA后海馬CA2和CA3區(qū)域都有高密度的受損缺血性神經(jīng)元。在ROSC后3小時將2.0×10^5 NSCs注入側(cè)腦室，保護了經(jīng)歷8分鐘窒息CA的大鼠大腦中的神經(jīng)元免受缺血。移植的NSCs顯著降低了海馬CA2區(qū)域的HDS。免疫熒光染色顯示了移植NSCs的分化，神經(jīng)發(fā)生的增強，以及干細胞治療在CA中的神經(jīng)保護涉及的潛在機制。ICV遞送NSCs增加了SVZ內(nèi)源性NSCs的增殖和遷移，以促進CA后的神經(jīng)發(fā)生。NSC治療在CA后上調(diào)了與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)表達，這可能有助于干細胞治療對神經(jīng)恢復的治療效果。ICV移植后28天，在海馬和皮層中PKH26陽性和NeuN（神經(jīng)元標記）陽性細胞的共定位驗證了從移植NSCs到神經(jīng)元的分化。

2.3.2.用鼻內(nèi)注射干細胞治療CA誘導的缺血性腦損傷基線ABG結(jié)果不同組大鼠在CA前的基線條件相似。包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基礎(chǔ)過量和SO2）和器官灌注（乳酸）在內(nèi)的基線ABG結(jié)果沒有顯著差異。神經(jīng)功能缺損評分Wang等人研究了鼻內(nèi)遞送NSCs在8分鐘窒息CA大鼠中的療效，并比較了NSC治療和格列本脲（GBC）治療的療效。在ROSC后3小時鼻內(nèi)遞送0.4×10^6 NSCs顯著改善了所有評估時間點（24小時，48小時和72小時）后的總體存活NDS。與GBC治療相比，NSC治療顯示出更好的神經(jīng)保護效果，如CA大鼠24小時后更好的NDS恢復所示。NSCs治療的動物顯示了嚴重神經(jīng)功能缺損（SND）的持續(xù)時間縮短，定義為NDS<60的持續(xù)時間，表明通過鼻內(nèi)途徑在早期階段的NSC治療縮短了ROSC后嚴重條件的時間。干細胞治療在外周神經(jīng)損傷中的應用外周神經(jīng)損傷（PNI）指的是對周圍神經(jīng)干或分支造成不同程度的損傷。PNI可能導致結(jié)構(gòu)性損害，從而導致運動和感覺功能的局部或完全喪失、神經(jīng)病理性疼痛和身體殘疾，進而嚴重影響生活質(zhì)量。PNI在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中很常見，據(jù)估計美國約有2000萬人受影響。盡管顯微外科技術(shù)取得了進展，修復神經(jīng)損傷仍然是臨床上難以解決的問題。雪旺細胞對神經(jīng)再生至關(guān)重要。然而，獲取雪旺細胞的侵入性質(zhì)限制了基于雪旺細胞治療的臨床應用。干細胞作為具有眾多再生優(yōu)勢的雪旺樣細胞來源，已成為有希望的替代性基于細胞的治療。干細胞分化成雪旺樣細胞時，可以加速巨噬細胞的募集和壞死細胞碎片的吞噬。同時，干細胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以增強軸突生長，包括神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）。此外，干細胞治療促進再生治療中的再髓鞘化。在本節(jié)中，我們介紹了實驗性PNI模型、干細胞遞送途徑、干細胞移植后的功能結(jié)果以及改進PNI干細胞治療的策略。

3.1.外周神經(jīng)損傷的實驗模型和干細胞移植周圍神經(jīng)病變可能由外傷引起。在臨床前模型中，神經(jīng)擠壓和橫斷傷是最常用的模擬外傷性PNI的方法。此外，PNI可能導致神經(jīng)病理性疼痛中的痛覺過敏和中樞敏化。其他主要關(guān)注神經(jīng)病理性疼痛的PNI模型包括慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫（CCD）模型、慢性束縛傷（CCI）模型和脛神經(jīng)及腓腸神經(jīng)橫斷模型。這里，我們介紹了這些PNI模型以及PNI后干細胞的管理。

3.1.1.神經(jīng)擠壓傷模型嚙齒動物的神經(jīng)擠壓傷模型是模擬外傷性PNI的最常用方法之一，先前已有報道。簡而言之，坐骨神經(jīng)被小心暴露，然后被擠壓10秒，每個間隔放松10秒，直到總擠壓時間為30秒。干細胞直接管理在坐骨神經(jīng)的擠壓傷處。

3.1.2.坐骨神經(jīng)橫斷和修復模型完全坐骨神經(jīng)橫斷是模擬患者嚴重外傷性PNI的典型嚴重PNI。坐骨神經(jīng)橫斷傷和修復模型已經(jīng)建立并描述得很好。簡而言之，動物通過吸入氧氣和異氟醚的混合物在面罩下麻醉。經(jīng)過無菌準備后，腿部皮膚和肌肉被分層分離以暴露坐骨神經(jīng)。為了產(chǎn)生超出周圍神經(jīng)系統(tǒng)有限再生能力的顯著神經(jīng)間隙，切除了坐骨神經(jīng)分叉點近端0.5厘米處的15毫米長的坐骨神經(jīng)，這是大鼠中的關(guān)鍵尺寸神經(jīng)間隙。近端和遠端神經(jīng)殘端各插入1毫米到17毫米長的神經(jīng)導管中，使用9-0縫合線創(chuàng)建15毫米的缺陷距離。在顯微鏡下，神經(jīng)殘端在每側(cè)使用9-0縫合線縫合。在坐骨神經(jīng)橫斷手術(shù)期間，使用神經(jīng)導向?qū)Ч芑蜃泽w神經(jīng)殘端修復坐骨神經(jīng)間隙。干細胞直接遞送到聚己內(nèi)酯納米纖維神經(jīng)導管中。根據(jù)實驗設(shè)計，將PBS注入導管或無細胞支架可作為對照組。

3.1.3.復雜神經(jīng)損傷模型復雜神經(jīng)損傷模型是一種新穎的坐骨神經(jīng)損傷和修復模型，模擬影響運動和感覺通路的復雜外傷性PNI。坐骨神經(jīng)在其分叉點近端和遠端0.5厘米處被切割1厘米長。在顯微鏡下，使用9-0縫合線將每個神經(jīng)殘端的神經(jīng)外膜附著到每側(cè)的神經(jīng)支架上。遠端運動通道縫合到腓腸肌的脛神經(jīng)運動分支，遠端感覺通道縫合到腓腸神經(jīng)，近端通道縫合到坐骨神經(jīng)。然后，皮膚和肌肉切口的各層被縫合在一起。干細胞直接遞送到3D神經(jīng)導管中。這種獨特的損傷模型使得在復雜PNI后，無論是否管理干細胞，都能在運動和感覺上進行再生演變。

3.1.4.背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型CCD是腰椎間盤突出癥和根性疼痛的臨床前PNI模型。CCD模型已經(jīng)建立并報道了椎間孔狹窄的方法。在皮膚和肌肉無菌解剖后，L4和L5的橫向過程和椎間孔可見。兩個無菌不銹鋼L形桿（4毫米長，直徑0.63毫米）被插入L4和L5的孔中。在收集背根神經(jīng)節(jié)（DRGs）時，驗證了桿的正確位置。在CCI模型中采用了直接經(jīng)皮注射細胞移植的方法。在異氟醚麻醉下，通過L4和L5之間的間隙推進帶有干細胞的HAMILTON微量注射器到達蛛網(wǎng)膜下腔。在通過尾 flick確認針頭位置在蛛網(wǎng)膜下腔后，謹慎且緩慢地注射干細胞。

3.1.5.慢性束縛傷模型神經(jīng)病理性疼痛的另一個常見PNI模型是通過單側(cè)松散結(jié)扎坐骨神經(jīng)的CCI模型。CCI模型通過在坐骨神經(jīng)分叉近端松散地打四個3-0鉻腸線結(jié)扎引起。結(jié)扎被仔細且緩慢地進行，以確保神經(jīng)的直徑可見且只有輕微的收縮。在CCI模型中，干細胞的局部應用直接靠近神經(jīng)、IP注射或IV遞送已被報道。

3.1.6.脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)橫斷模型這種嚙齒動物PNI模型通常涉及橫斷脛神經(jīng)和/或腓腸神經(jīng)以誘導機械性過敏。一旦分叉完全暴露并確認結(jié)構(gòu)，就從它們的起源處2毫米的距離移除脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)各2毫米的片段。常見的腓總神經(jīng)沒有被觸摸，保持完整。像在坐骨神經(jīng)損傷和修復模型中管理的干細胞一樣，使用含有干細胞的神經(jīng)導向?qū)Ч軄硇迯蜕窠?jīng)間隙。

3.2.周圍神經(jīng)損傷后干細胞治療的系統(tǒng)評估
3.2.1.電生理評估電生理記錄在損傷前后均使用Tucker-Davis Technologies系統(tǒng)（TDT，Alachua，F(xiàn)L）通過前置放大器進行。記錄針電極放置在遠端坐骨神經(jīng)或腓腸肌內(nèi)。接地電極放置在動物尾部以最小化噪聲。放置在神經(jīng)近端的電極接受500 μA或1 mA的刺激，脈沖寬度為100 μs，頻率為0.5 Hz。同時記錄了脛骨前肌的電機誘發(fā)電位（MEP）和遠端神經(jīng)的復合電機動作電位（CMAP）。每個刺激重復四次，每次持續(xù)1分鐘，間隔2分鐘以供放松。記錄在受傷和未受傷的兩側(cè)均進行。在MEP和CMAP中分別分析M波以及潛伏期和峰峰幅度�；谛旁氡仍O(shè)置了一個閾值來檢測峰值，該閾值是信號均值的兩到三倍標準差以上。如果峰值低于此閾值，則被認為是噪聲。Du等人研究了神經(jīng)嵴干細胞（NCSC）治療在周圍神經(jīng)損傷（PNI）后的治療效果，在五個實驗組中進行了研究，包括空白對照組、NCSC治療組、電刺激（ES）組、基于體外研究的聯(lián)合NCSC和優(yōu)化ES治療組以及自體神經(jīng)移植組。優(yōu)化的ES增強了2×10^6 NCSCs的治療效果，提高了大鼠PNI后神經(jīng)傳導性。在NCSC治療組和聯(lián)合NCSC與優(yōu)化ES組中觀察到CAMP和MEP中更多的可檢測信號，顯示了干細胞治療在坐骨神經(jīng)橫斷和修復后神經(jīng)再生的有益效果。在另一項利用大鼠坐骨神經(jīng)損傷和修復模型的研究中，Du等人比較了移植5代（p5）或6代（p6）NCSCs后神經(jīng)恢復情況，電生理評估表明，用5代NCSCs治療的大鼠比用6代NCSCs治療和未治療動物有更好的可檢測CMAP和MEP信號，從而驗證了NCSCs在大鼠PNI后的效果，其中p5 NCSCs優(yōu)于p6 NCSCs。

3.2.2.Catwalk步態(tài)分析Catwalk，一種步態(tài)分析工具，已在臨床前研究中得到很好的建立，用于評估步態(tài)恢復。大鼠在手術(shù)前一周開始每天在Catwalk系統(tǒng)上訓練，直到它們能夠連續(xù)成功穿越走道三到五次而不停止。在測試當天，大鼠在走道上自由行走，并在走道上左右移動。當大鼠爪子接觸走道的玻璃板時，照亮的接觸區(qū)域被自動記錄（圖2）。每只大鼠總共完成三到五次連續(xù)、不間斷的跑步。Catwalk系統(tǒng)自動從以下指標中收集兩只后肢的數(shù)據(jù)：給定爪子的總打印區(qū)域（打印區(qū)域）、打印的平均壓力（平均強度）、每步承重時間（站立時間）、每個步行周期中承重時間的百分比（占空比）、步間肢體速度（擺動速度）和步間距離（步幅長度）。對側(cè)后爪被用作比較對照，以避免動物體重和步行速度的混雜效應。計算受傷同側(cè)后肢與對側(cè)健康后肢的比率，并調(diào)整到基線同側(cè)/對側(cè)比率。與對側(cè)標準化的目標是減少因體重和跑步校準引起的方差。所有數(shù)據(jù)都轉(zhuǎn)換為百分比，并由對側(cè)的健康腿進行歸一化。開發(fā)并采用了一種手動處理方法，用于錯誤校正，以確保正確分析并從Catwalk軟件的自動分析中去除錯誤，以驗證所有跑步。首先，任何未分類的腳印都被相應地分配到正確的肢體。其次，所有噪聲信號，包括來自鼻子、尾巴、腹部和生殖器的信號，都被手動標記為“垃圾”。第三，被錯誤識別為屬于多個爪子的單個腳印被更正為單個步驟。每個肢體需要至少兩個步驟來計算動態(tài)數(shù)據(jù)，如占空比、擺動速度和步幅長度。少于兩個步態(tài)周期的跑步不包括在分析中。在PNI后使用2×10^6 NCSCs的基于細胞的治療改善了大鼠坐骨神經(jīng)橫斷和修復模型的恢復結(jié)果。手術(shù)修復后，站立時間、擺動速度和平均強度從第6周逐漸增加到第12周。前肢強度從第2周至第6周的改善表明了PNI后運動功能的逐漸恢復。與非治療組相比，NCSC治療顯著延長了站立時間，并在坐骨神經(jīng)損傷后12周增加了主要強度。總體比較顯示，NCSC組在手術(shù)后6周的占空比大于非治療組。NCSC治療在坐骨神經(jīng)橫斷后2周和12周增加了步幅長度。NCSC移植與優(yōu)化ES促進了大鼠坐骨神經(jīng)橫斷和修復后的功能步態(tài)恢復，導致PNI后6周和12周的站立時間和占空比延長。步態(tài)分析表明，NCSC治療組在坐骨神經(jīng)損傷后12周顯示出更協(xié)調(diào)的前肢和后肢腳印、更大的平均強度和更長的占空比。Catwalk分析還證實，用5代NCSCs治療比6代NCSCs治療有更優(yōu)越的步態(tài)恢復。用NCSCs治療PNI在步態(tài)分析中顯示出有利的結(jié)果。與接受無細胞支架的大鼠相比，接受NCSC治療的大鼠顯示出更高的站立指數(shù)和最大強度。

圖 2 Catwalk分析系統(tǒng)的代表性圖片。(a) 大鼠從Catwalk XT系統(tǒng)的一端1.0米封閉走道移動到另一端。前肢和后肢的腳印都被自動捕獲。(b-e) Catwalk系統(tǒng)中由“自動分類”功能引起的典型錯誤示例，以及手動校正和調(diào)整。(b) 檢測到未分類的右后肢步態(tài)。通過指定適當?shù)念悇e進行更正。(c) 由于垃圾顆粒被歸類為步態(tài)，導致不準確的跑步分類。通過將垃圾顆粒識別為“JUNK”來修復錯誤。(d) 單個步態(tài)被分類為兩個步態(tài)。合并步態(tài)以進行更正。(e) 動物改變方向并以前左后肢為支點向右轉(zhuǎn)。通過移除受不良依從性影響的步態(tài)進行更正。

3.2.3.痛覺相關(guān)行為測試痛覺行為測試，包括機械撤退閾值（MWT）和熱撤退潛伏期（TWL），用于評估PNI后感覺功能的恢復。使用電子機械鎮(zhèn)痛測試儀確定MWT。將玻璃箱放置在金屬框架篩上。大鼠在實驗前30分鐘被放置在箱中以適應環(huán)境。電子機械刺激器的截止力設(shè)置為50克。測試針觸碰大鼠后爪的內(nèi)側(cè)足底表面，直到表現(xiàn)出逃跑行為�？焖俪吠嘶蜃ψ宇澏侗灰暈殛栃苑磻�。每只大鼠進行三次測試，每次評估之間休息5分鐘。每只動物的MWT計算為連續(xù)三次檢查的平均值。使用自動熱痛刺激器檢測TWL。將玻璃箱放置在3毫米厚的玻璃板上，輻射燈在桌子下方。大鼠在實驗前30分鐘被放置在箱中以適應環(huán)境。在測試期間，刺激溫度設(shè)置為45°C。使用光照射刺激下肢足底表面，直到發(fā)生撤退反應。當大鼠抬起或舔其后爪時，疼痛潛伏期的記錄結(jié)束。為了防止組織損傷，設(shè)定了25秒的截止時間。每只大鼠進行了三輪測試，每輪間隔5分鐘，所有三次測試結(jié)果的平均值被確定為此次測量的TWL。鞘內(nèi)遞送BMSCs顯示出對CCD的機械痛覺過敏有強烈且短暫的緩解作用。CCD動物在MWT中表現(xiàn)出更長時間的爪子撤退和更多的舔舐行為�；贐MSCs的細胞治療在治療后1天顯著減輕了這些痛覺過敏行為，表現(xiàn)為爪子撤退時間減少。外周遞送NCSCs減輕了坐骨神經(jīng)橫斷引起的疼痛。在PNI后12周觀察到下肢足底表面的機械和熱痛覺過敏。用外周給藥的NCSCs在NWT和TWL測量中緩解了坐骨神經(jīng)橫斷引起的疼痛。

3.2.4.修改的Wall評分自殘行為是PNI后去神經(jīng)支配肢體的常見行為，在嚙齒動物模型中，特別是在坐骨神經(jīng)損傷后的大鼠中，其發(fā)生率幾乎達到40-80%。使用修改的Wall評分每周進行自殘評估，以檢查手術(shù)足自殘行為。0分表示無自殘。對于每個受影響的手指，指甲損傷給予1分，影響指骨的損傷給予2分，影響掌骨的損傷給予3分。修改的Wall評分范圍從0到15分。PNI后嚴重自殘被定義為修改的Wall評分超過4分。每周計算修改的Wall評分，以評估裸鼠和Wistar大鼠在接受NCSCs治療后PNI的自殘行為�？傮w而言，與Wistar大鼠相比，裸鼠在坐骨神經(jīng)橫斷后表現(xiàn)出較少的自殘行為。在坐骨神經(jīng)橫斷損傷后2、4、6、9和12周，Wistar大鼠的Wall自殘評分高于裸鼠，并且在Wistar大鼠中觀察到更高頻率的嚴重自殘類型（修改的Wall評分≥4）。在第一周內(nèi)，裸鼠和Wistar大鼠的自殘發(fā)生率較低，隨后從第2周至第6周急劇增加，并持續(xù)整個12周實驗。

3.2.5.肌肉質(zhì)量測量在PNI中坐骨神經(jīng)橫斷后，神經(jīng)肌肉支配被阻斷，導致去神經(jīng)支配的腓腸肌萎縮。肌肉質(zhì)量測量是評估PNI后功能恢復的另一個重要指標。在安樂死后，仔細收集受傷和未受傷側(cè)的腓腸肌，并記錄肌肉重量。為了消除不同體重對絕對肌肉重量的混雜效應，應用腓腸肌指數(shù)（GMI）來評估PNI引起的萎縮后肌肉質(zhì)量恢復的程度。GMI是通過將受傷側(cè)的腓腸肌質(zhì)量除以未受影響的對側(cè)質(zhì)量來計算的。在NCSC治療組、自體移植治療組和非治療組之間，腓腸肌重量顯示出不同的恢復。在6周和12周時，自體移植治療的腓腸肌重量高于NCSC和僅導管非治療組。與非治療和僅ES治療組相比，NCSC治療和優(yōu)化ES進一步減輕了肌肉萎縮，這兩組在恢復12周后肌肉更小。NCSCs與優(yōu)化ES的聯(lián)合治療在坐骨神經(jīng)橫斷后6周和12周顯示出最高的GMI。在非治療組中，腓腸肌的纖維橫截面積顯示出形狀不規(guī)則的小纖維。相比之下，NCSC組的腓腸肌顯示出均勻分布的纖維直徑和規(guī)則大小。給予5代NCSC或6代NCSCs減少了腓腸肌中的脂肪浸潤和肌小節(jié)變性，顯示出更健康的肌肉纖維。3.2.6.組織病理學評估甲苯胺藍染色使核酸呈現(xiàn)藍色，多糖呈現(xiàn)紫色。甲苯胺藍染色的神經(jīng)切片的組織形態(tài)可以用來定量分析干細胞治療后的有髓纖維。在電子顯微鏡下檢查髓鞘的外緣和內(nèi)緣的長度，以定量分析纖維直徑（FD）和軸突直徑（AD）。根據(jù)纖維和軸突直徑計算髓鞘厚度（髓鞘厚度 = FD - AD）。用2×10^6 NCSCs治療促進了坐骨神經(jīng)損傷和修復后的再髓鞘化。細胞計數(shù)分析顯示，在神經(jīng)修復后6周和12周，NCSC治療組的有髓軸突更多。在另一項研究中，對照組再生神經(jīng)組織在6周和12周時顯示出稀疏或小片狀，表明在橫斷后存在15毫米的神經(jīng)間隙，再生不成功。經(jīng)過NCSCs治療后，有髓軸突數(shù)量增多，有髓軸突密度增強，軸突直徑增加，髓鞘厚度增加。免疫熒光染色顯示，人NCSC治療在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型中增強了神經(jīng)再生，人NCAM（人細胞系標記）、微管蛋白（軸突標記）和S-100（施萬細胞標記）的熒光信號更強。5代NCSCs的治療效應優(yōu)于6代NCSCs在坐骨神經(jīng)損傷治療中的效果。嘌呤受體P2X4（也稱為P2X4R），是離子型ATP受體的一個亞型，被認為在痛覺過敏的發(fā)病機制中特別重要，通過免疫組化和Western blot在大鼠CCD模型中上調(diào)。體外，BMSC治療后激活的小膠質(zhì)細胞中P2X4R的表達水平下降。體內(nèi)，鞘內(nèi)注射BMSCs下調(diào)了脊髓小膠質(zhì)細胞中P2X4R的表達，但不影響DRG神經(jīng)元中TRPV4的表達。鞘內(nèi)給藥BMSCs在PNI后緩解疼痛的主要機制可能包括P2X4R的調(diào)節(jié)。

3.3.提高周圍神經(jīng)損傷中干細胞治療的效果
3.3.1.聯(lián)合治療電刺激電場可以通過調(diào)節(jié)離子通道分布來增強細胞增殖、遷移和軸突生長。優(yōu)化的電刺激（ES）在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型中進一步改善了NCSC治療的神經(jīng)保護效果。基于體外NCSCs形態(tài)變化和細胞分化改善，確定了優(yōu)化的刺激參數(shù)（200 mV/mm強度和100 ms持續(xù)時間）。這種優(yōu)化的ES促進了NCSCs的分化和增殖。微管蛋白免疫染色顯示軸突再生的神經(jīng)保護效果，NCSC+ES治療比單獨NCSC治療更有效。NCSC+ES治療還促進了有髓軸突密度、軸突直徑和髓鞘厚度的增加，改善了神經(jīng)傳導性，減輕了肌肉萎縮，并加速了步態(tài)恢復。與NCSC治療相比，NCSC與優(yōu)化ES的聯(lián)合治療顯示出更顯著的治療效果，表明優(yōu)化的ES增強了大鼠坐骨神經(jīng)損傷和修復后干細胞治療的效果。

電針將MSCs和電針（EA）治療結(jié)合起來治療急性坐骨神經(jīng)損傷，加速了髓鞘再生，增強了軸突延伸，并最終促進了PNI后大鼠的功能恢復。MRI監(jiān)測顯示，與PBS對照組相比，MSCs治療組在3周和4周時神經(jīng)水腫的減少更快。MSCs給藥增加了MRI中的分數(shù)各向異性（FA）值，證明了受損神經(jīng)中的軸突再生。聯(lián)合治療組在PNI后3、4和6周觀察到最高的FA值。從組織學評估來看，聯(lián)合治療（MSCs+EA）顯示出再生有髓纖維數(shù)量最多和近端髓鞘神經(jīng)纖維直徑最大。它改善了神經(jīng)纖維連續(xù)性的恢復。

脈沖磁場脈沖磁場（PMF）增強了MSCs在CCI模型大鼠中的治療效果。研究了MSCs治療（時間依賴性 - PNI后1天或1周；途徑依賴性 - 系統(tǒng)性或局部）的療效、PMF及其聯(lián)合治療。2×10^6 MSCs的系統(tǒng)性給藥和1×10^6直接在受損神經(jīng)附近的局部注射均緩解了熱痛覺過敏和機械痛覺過敏，表現(xiàn)為撤退潛伏期增加和平均閾值提高。與單獨使用MSCs相比，使用MSCs和PMF的聯(lián)合治療顯著增強了潛伏期和閾值。MSCs的治療效果不受給藥方法（IP與局部）或時間（通過IP在PNI后1天或1周）的顯著影響。此外，在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中沒有觀察到時間依賴性差異。只有IP給藥，而不是局部注射，的MSCs增強了抗炎細胞因子的表達，并抑制了促炎因子的表達。其他聯(lián)合治療粒細胞集落刺激因子（G-CSF），屬于造血生長因子家族的蛋白質(zhì)，被認為與造血前體細胞的存活、增殖和分化有關(guān)。一項研究表明G-CSF增強了移植MSCs對PNI的神經(jīng)保護效果。局部注射MSCs到神經(jīng)減輕了凋亡，增強了再髓鞘化，并改善了運動功能。G-CSF的IP給藥抑制了壓碎傷害介導的炎癥細胞因子，減少了凋亡，增加了神經(jīng)髓鞘化，并改善了功能恢復。在聯(lián)合治療組中，MSCs被輸送到受損神經(jīng)，隨后G-CSF被注射到腹腔內(nèi)，對周圍神經(jīng)再生產(chǎn)生了額外的有益效果。移植的MSCs中凋亡死亡的減少和炎癥反應的抑制涉及協(xié)同效應。發(fā)酵大豆提取物（納豆），作為一種傳統(tǒng)飲食食品，可以促進循環(huán)中的纖溶活性，并通過抑制纖維蛋白沉積來抑制施萬細胞的凋亡。在周圍神經(jīng)擠壓傷的大鼠模型中，研究了間充質(zhì)干細胞（MSCs）和納豆的協(xié)同效應。MSCs、納豆或聯(lián)合療法的給藥改善了神經(jīng)再生。納豆減少了移植MSCs中的凋亡，并顯著增加了神經(jīng)絲早期再生標志物和S-100晚期標志物的表達，從而增強了MSC治療的有益效果。納豆還抑制了施萬細胞的凋亡并下調(diào)了神經(jīng)炎癥。與單獨使用MSCs或納豆治療相比，聯(lián)合療法產(chǎn)生了最顯著的益處。

3.3.2.生物材料：3D神經(jīng)支架3D支架，一種3D打印方法，用于設(shè)計、優(yōu)化和制造定制的神經(jīng)修復支架，以促進周圍神經(jīng)損傷（PNI）中的再生。定制支架從3D解剖結(jié)構(gòu)重建，提供軸突引導，有利于趨化功能。它為影響運動和感覺通路的復雜神經(jīng)損傷提供了解決方案，并增強了組織再生。在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型中，使用無細胞或神經(jīng)祖細胞（NCSC）負載的3D神經(jīng)支架修復復雜的坐骨神經(jīng)間隙損傷。坐骨神經(jīng)修復后，NCSC負載的神經(jīng)支架緩解了神經(jīng)病理性疼痛，并增強了PNI后的運動功能恢復。NCSC負載的3D支架組顯著減少了同側(cè)后爪內(nèi)側(cè)掌面的機械和熱性痛覺過敏。在3D支架治療NCSC后，免疫熒光分析顯示星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的激活減少。

3.3.3.生物活性因子預處理Netrins是一類分泌蛋白，調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞的遷移和軸突引導，在神經(jīng)發(fā)育期間。用過度表達的Netrin-1修飾MSCs促進了PNI大鼠模型的功能恢復。與MSC治療相比，用預修飾的MSCs治療在受傷后28天顯示出更多的施萬細胞。用Netrin-1預處理的MSCs給藥后，BDNF和NGF的表達增加，并改善了坐骨神經(jīng)損傷后的運動神經(jīng)傳導。神經(jīng)生長因子（NGF）是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)肽，主要參與調(diào)節(jié)特定目標神經(jīng)元的生長、維持、增殖和存活。Moattari等人報告說，NGF預處理的MSCs在大鼠坐骨神經(jīng)損傷后2周和8周增加了坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI），并縮短了熱水爪浸入測試的時間。用NGF-MSCs治療顯示出更好的電生理恢復，增加了幅度并減少了潛伏期。組織學評估還表明，在NGF-MSC組中，神經(jīng)纖維、血管的數(shù)量和血管面積的百分比有更顯著的增加�；镜娜祟惓芍蜃映衫w維細胞生長因子1（FGF-1），它參與組織生長，通過提供額外的細胞生存信號來保護細胞免受壓力。FGF1-MSC治療在大鼠CCI神經(jīng)病理性疼痛模型中調(diào)節(jié)了凋亡和神經(jīng)炎癥。在CCI模型的PNI后，凋亡蛋白和炎癥標志物增加，并在MSCs和FGF1-MSCs給藥后得到緩解。FGF1-MSCs的效果顯著高于MSCs。

3.3.4.電磁場預處理低頻脈沖電磁場（PEMF）預處理促進了MSCs在坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的治療效率。體外實驗中，低頻PEMF促進了BMSCs的增殖和神經(jīng)元分化。與未經(jīng)預處理的BMSCs相比，低頻PEMF修飾的BMSCs增殖更快，并表達了更高水平的生長因子mRNA。注射低頻PEMF預處理的BMSCs增加了三叉神經(jīng)節(jié)中髓鞘軸突的數(shù)量、軸突密度和存活神經(jīng)元的數(shù)量，從而加速了神經(jīng)再生。

3.3.5.針對周圍神經(jīng)損傷引起的脊髓損傷PNI引起的病理癥狀，如感覺異常/過敏、對周圍神經(jīng)刺激的異常反應和脊髓回路，與脊髓和DRG中的分子和形態(tài)變化有關(guān)，包括細胞凋亡、神經(jīng)退行性和小膠質(zhì)細胞激活。到目前為止，大多數(shù)干細胞治療研究集中在受損周圍神經(jīng)的功能恢復上，忽視了PNI引起的脊髓病理變化，特別是小膠質(zhì)細胞的激活和招募以及與凋亡相關(guān)的神經(jīng)元死亡，這可能是臨床患者在PNI后即使在治療干預后仍遭受慢性病理性疼痛的原因之一。鑒于脊髓、DRG和周圍神經(jīng)在解剖上彼此接近，以及周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在功能上相連，針對PNI引起的脊髓損傷的治療策略可能會增強干細胞治療在PNI中的使用。在手術(shù)后第4天和第5天將1 10^6 BMSCs鞘內(nèi)注入脊髓，抑制了背角神經(jīng)元的退行性變，增強了神經(jīng)再生，并緩解了坐骨神經(jīng)損傷后的病理性疼痛。針對PNI引起的脊髓病理變化的周圍給藥2 10^6 NCSCs取得了有利的結(jié)果，緩解了神經(jīng)病理性疼痛并增強了運動性能。

4.結(jié)論和未來展望
由于其再生能力，干細胞治療已成為增強神經(jīng)疾病功能恢復的有希望的替代治療方法。本章總結(jié)的臨床前研究支持了干細胞治療在全球腦缺血引起的CA和PNI后神經(jīng)退行性變中的治療潛力。許多類型的干細胞可以用于干細胞治療，包括多能干細胞、NSCs、MSCs、臍帶血干細胞和其他細胞類型。不同類型干細胞的安全性、可靠性、最大效率和可能的副作用，如腫瘤形成，需要進一步調(diào)查。最佳劑量、給藥時間、干細胞輸送方法以及細胞預處理和預條件以提高干細胞治療的效率需要進一步研究。對于PNI，局部注射干細胞的一個潛在擔憂是程序的侵入性質(zhì)，這可能會降低臨床轉(zhuǎn)化。一項臨床研究將干細胞局部注射到臨床患者中。治療效果沒有報告炎癥、感染或出血。除了關(guān)注PNI引起的脊髓損傷外，其他可能產(chǎn)生類似治療效果的周圍給藥途徑或其他輸送策略，需要在未來的研究中驗證。衰老是干細胞治療的另一個重要問題。為了最小化由衰老引起的功能損失，至關(guān)重要的是要闡明如何快速準確地檢測干細胞的衰老比例和程度。通過解決這些問題，干細胞治療最終可能成為神經(jīng)疾病的臨床可行和有效治療方法，并在未來提高患者的生活質(zhì)量。

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二．凍存液