CAR-T細胞衍生外泌體的生物學(xué)功能及在各類癌癥治療中的優(yōu)勢

原創(chuàng) 彪彪 文章來源：生物制品圈

摘要:嵌合抗原受體（CAR）-T細胞過繼免疫療法是一種有前景的癌癥治療方法，它利用基因工程化的T細胞攻擊腫瘤。然而，這種療法可能會有一些不良反應(yīng)。來源于CAR-T細胞的外泌體是CAR-T細胞的潛在替代品，可能克服一些限制。外泌體是細胞釋放的小囊泡，可以攜帶多種分子，包括蛋白質(zhì)、RNA和DNA。它們在細胞間通訊中扮演重要角色，并且可以用來向癌細胞輸送治療劑。應(yīng)用來源于CAR-T細胞的外泌體可以使CAR-T細胞療法在臨床上更加可控和有效。外泌體是無細胞的，這意味著它們比CAR-T細胞更不可能引起不良反應(yīng)。CAR-T細胞和外泌體的結(jié)合可能比單獨任一療法更有效地治療癌癥。外泌體可以向CAR-T細胞無法到達的癌細胞輸送治療劑。適當應(yīng)用細胞和外泌體平臺可以使CAR-T細胞療法成為更實用的癌癥治療方法。這種組合療法可以為治療多種癌癥提供一種安全有效的方式。

1.引言

近年來，癌癥免疫療法已成為主要的治療選擇之一。其中最有前景的方法之一是嵌合抗原受體（CAR）-T細胞療法，該療法涉及工程化T細胞以靶向特定的癌細胞。然而，CAR-T細胞療法也可能產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如細胞因子釋放綜合征（CRS）。CRS的特點是細胞因子的快速和過量釋放，導(dǎo)致細胞因子風暴。當大量的促炎和炎癥細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、可溶性IL-2受體α（可溶性IL-2Rα）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、可溶性IL-6R和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）被釋放到血液中時，就會發(fā)生細胞因子風暴。細胞因子風暴觸發(fā)免疫反應(yīng)，引起廣泛的炎癥和免疫細胞的激活。這種免疫超激活可能會攻擊重要器官，包括肺、肝、腎、心、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。外泌體是體內(nèi)許多細胞分泌的一種細胞外囊泡。它們已被證明在細胞間通訊中發(fā)揮作用，并且可能能夠向癌細胞輸送治療性貨物。使用來源于CAR-T細胞的外泌體作為一種治療方法，可能會提供更多的治療過程控制，并幫助降低不良反應(yīng)的風險。外泌體是癌癥免疫療法中的一個有前景的新研究點，它們有可能徹底改變癌癥的治療方法。本綜述聚焦于CAR-T細胞和來源于CAR-T細胞的外泌體在癌癥模型中的治療潛力。

2.外泌體概述（內(nèi)容、生物合成和攝�。�

細胞外囊泡（EVs）的分類主要分為兩大類：外泌體和外泌體。外泌體通過質(zhì)膜的外向出芽形成，形成大小范圍約為50納米至1微米的微囊泡，而內(nèi)源性的外泌體則來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其大小范圍為40納米至約160納米（平均約100納米）。多年來，已確定這兩種外泌體分類在生理和病理上都發(fā)揮作用。但在過去十年中，越來越多的證據(jù)表明，膜囊泡是細胞間通訊中的重要信使。外泌體是這些囊泡中最被研究和特征明確的。外泌體通過質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷形成。首先，內(nèi)陷形成一個杯狀結(jié)構(gòu)，從早期分選內(nèi)質(zhì)體（ESEs）開始，它們通過跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的貢獻成熟為晚期分選內(nèi)質(zhì)體（LSEs），隨后，內(nèi)質(zhì)膜的內(nèi)陷形成含有腔內(nèi)囊泡（ILVs，未來的外泌體）的多囊泡體（MVBs）。最終，外泌體將通過MVB與質(zhì)膜的融合被釋放（圖1）。由于大小差異、內(nèi)容、細胞起源和在受體細胞中的功能，外泌體是異質(zhì)的。它們的大小異質(zhì)性來自于外泌體內(nèi)容物在MVBs中的不均勻內(nèi)陷。外泌體的內(nèi)容物可能因其功能而異；通常，外泌體具有以下貨物：膜蛋白、細胞質(zhì)和核蛋白，以及細胞外基質(zhì)和核酸，如mRNA、非編碼RNA種類和DNA。它們對受體細胞的作用和影響也可能因細胞表面受體而異，可以誘導(dǎo)細胞存活、凋亡和免疫調(diào)節(jié)。關(guān)于外泌體，異質(zhì)性也可以由它們的細胞起源引起。外泌體的攝取與多種機制有關(guān)，如依賴于clathrin的內(nèi)吞作用、吞噬作用和微囊泡吞噬作用。外泌體具有多種表面分子，使它們能夠與許多受體細胞相互作用。這意味著外泌體可以向不同細胞傳遞多種信號，或者在細胞上沒有生理功能，僅作為營養(yǎng)水平的放大器。

圖1 外泌體、微囊泡和凋亡小體是不同類型胞外囊泡（EVs），在細胞間通訊中扮演重要角色。外泌體是通過內(nèi)膜向內(nèi)出芽形成的小囊泡，而微囊泡是通過質(zhì)膜向外出芽形成的較大囊泡。凋亡小體是在程序性細胞死亡過程中釋放的囊泡。這些EVs攜帶各種分子，并且可以被鄰近細胞攝取，促進通訊和生物材料的轉(zhuǎn)移。

3.外泌體的生物學(xué)功能

如前所述，外泌體具有生理和病理屬性。它們可以攜帶多種分子，包括microRNAs、mRNAs和蛋白質(zhì)。外泌體可以將這些分子傳遞給其他細胞，這些細胞隨后可以使用它們來改變它們的行為。這個過程被稱為外泌體介導(dǎo)的細胞間通訊。外泌體可以與近鄰的細胞通訊，也可以通過血液循環(huán)與身體其他部位的細胞通訊。外泌體甚至可以通過血腦屏障，該屏障將血液與大腦分開。有報道稱，外泌體是細胞間相互通訊的多功能方式。它們可以同時傳遞多個信號，并且可以針對多個細胞和多個位置。這使得外泌體成為細胞間通訊的強大工具。外泌體是一個迅速發(fā)展的研究領(lǐng)域�？茖W(xué)家們?nèi)栽诹私馑鼈兊脑S多功能。然而，很明顯，外泌體在細胞間通訊和許多其他生物過程中發(fā)揮著重要作用。

美國食品藥品監(jiān)督管理局批準了CAR-T細胞療法作為第一種基因療法。表達嵌合抗原受體（CAR）的基因工程T細胞作為一種有前途的新療法，正在迅速崛起，用于治療血液學(xué)和非血液學(xué)惡性腫瘤。在實體瘤中，CAR-T療法并未取得在血液學(xué)惡性腫瘤中觀察到的臨床成功�；�于CAR的過繼免疫療法使用基因修飾的T淋巴細胞提供腫瘤靶向和免疫反應(yīng)，可以作為活體藥物，對目標細胞進行持續(xù)的細胞毒性攻擊。CAR-T細胞及其在體內(nèi)的復(fù)制可以增強細胞因子釋放，這不容易控制。這種效應(yīng)是潛在的副作用來源，如CRS（細胞因子釋放綜合征）、細胞因子風暴和靶向腫瘤外的反應(yīng)。

3.1.實體瘤癌癥

CAR-T細胞療法徹底改變了癌癥治療領(lǐng)域，特別是在血液學(xué)惡性腫瘤的管理中。然而，其在實體瘤中的應(yīng)用由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，如異質(zhì)性和惡劣的腫瘤微環(huán)境，提出了獨特的挑戰(zhàn)。在目標識別、增強腫瘤滲透、管理毒性和探索聯(lián)合療法方面的進展，為CAR-T細胞療法在抗擊實體瘤中的有效使用帶來了希望，使我們更接近個性化和精確的癌癥治療。

目標選擇確實是CAR-T細胞療法在實體瘤中的一個重要障礙。實體瘤組織復(fù)雜的性質(zhì)和不同腫瘤細胞中蛋白質(zhì)表達譜的變異性，使得識別能夠有效覆蓋所有腫瘤細胞的目標變得具有挑戰(zhàn)性。即使抗原陽性的腫瘤細胞被消除，仍有大量抗原陰性細胞可能持續(xù)存在，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)率高。

實體瘤目標選擇的困難之一是實體瘤細胞源自健康組織。許多在腫瘤細胞中高度表達的抗原也在正常細胞中少量表達。這在避免非特異性殺傷健康細胞方面提出了挑戰(zhàn)，導(dǎo)致靶向腫瘤外的副作用。腫瘤異質(zhì)性是CAR-T細胞療法在實體瘤中的另一個重大挑戰(zhàn)。實體瘤通常表現(xiàn)出高水平的異質(zhì)性，意味著同一患者內(nèi)的不同腫瘤細胞可能不表達相同的腫瘤相關(guān)抗原。因此，如果CAR-T細胞識別單一目標來治療實體瘤，療法的成功可能取決于腫瘤的異質(zhì)性。

CD133，一種新的腫瘤干細胞標記物，已被確定為在許多實體瘤中過表達的目標，并正在作為CAR-T細胞療法的目標進行探索。然而，實體瘤的高度異質(zhì)性使得其治療比血液學(xué)惡性腫瘤更具挑戰(zhàn)性。關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于選擇能夠有效解決實體瘤異質(zhì)性和復(fù)雜性的目標。

已觀察到CAR-T細胞返回淋巴和血液系統(tǒng)，增加了遇到血液腫瘤細胞的可能性。CAR-T細胞療法在實體瘤中的成功取決于其穿透腫瘤組織通過血管內(nèi)皮細胞的能力。

CAR-T細胞進入實體瘤的有限遷移和侵襲可以歸因于腫瘤微環(huán)境中存在的密集纖維化基質(zhì)和促進T細胞滲透到腫瘤組織中的趨化因子的下調(diào)。

實體瘤中惡劣的免疫抑制腫瘤微環(huán)境進一步復(fù)雜化了CAR-T細胞療法。腫瘤微環(huán)境（TME）是一個復(fù)雜的環(huán)境，由各種細胞外基質(zhì)、基質(zhì)細胞、炎癥細胞和血管組成。在實體瘤中，TME的特點是血管化低、缺氧和細胞外基質(zhì)濃度高。有幾個因素促成了免疫抑制TME，對CAR-T細胞療法提出了重大挑戰(zhàn)。實體瘤通常表現(xiàn)出酸性TME，這是由于增加的糖酵解和乳酸產(chǎn)生。低pH值抑制T細胞功能，并通過損害CAR-T細胞活性和細胞因子產(chǎn)生促進免疫逃逸。

在實體瘤中，TME的特點是難以獲得色氨酸，這是一種對T細胞最佳功能至關(guān)重要的必需氨基酸。腫瘤細胞和免疫抑制細胞，如骨髓源性抑制細胞（MDSCs），可以通過酶色氨酸2,3-雙加氧酶（IDO）消耗色氨酸，導(dǎo)致T細胞抑制。實體瘤通常在TME中有低氧水平（缺氧）區(qū)域。缺氧可以損害CAR-T細胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細胞的有效性。TME中的免疫抑制細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、MDSCs和腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs），分泌免疫抑制分子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）和程序性細胞死亡配體1（PD-L1）。這些分子抑制CAR-T細胞活性，抑制免疫反應(yīng)，并促進腫瘤免疫逃逸。

這些因素共同在實體瘤內(nèi)創(chuàng)造了一個免疫抑制和惡劣的環(huán)境，阻礙了CAR-T細胞療法的效力�？朔�這些挑戰(zhàn)是研究的重點，涉及增強CAR-T細胞持久性、調(diào)節(jié)TME和將CAR-T療法與其他免疫調(diào)節(jié)方法相結(jié)合的策略，以改善實體瘤的治療結(jié)果。

3.2.肺癌治療

肺癌確實是全球最普遍且致死率最高的癌癥之一。不幸的是，大部分肺癌患者在晚期才被診斷出，此時治療選擇有限，導(dǎo)致5年生存率大約只有10-20%。盡管外科切除結(jié)合輔助治療仍是主要的治療策略，但只有少數(shù)患者符合手術(shù)條件，手術(shù)后的復(fù)發(fā)仍是一個重大問題。因此，迫切需要探索新的治療策略，以阻止腫瘤進展并改善肺癌患者的生存結(jié)果。

CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤中已證明成功，為治療實體瘤，包括肺癌，提供了新的希望。然而，它面臨著與其他實體瘤相似的挑戰(zhàn)，如前所述。此外，CAR-T細胞的臨床應(yīng)用受到腫瘤溶解綜合征、神經(jīng)毒性綜合征和細胞因子釋放綜合征等挑戰(zhàn)的阻礙。

根據(jù)提供的信息，對于患有肺癌的患者，有一系列潛在的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）可用于CAR-T細胞療法。值得注意的是，選擇CAR-T細胞療法的最佳TAA取決于多種因素，包括腫瘤的特定特征及其微環(huán)境。需要進一步的研究和臨床試驗來確定在CAR-T細胞療法中針對這些TAAs的療效和安全性：

• 表皮生長因子受體（EGFR）是一種在實體瘤中經(jīng)常過表達的蛋白質(zhì)，包括肺癌和腦轉(zhuǎn)移。EGFRvIII是EGFR的一種變體，在肺癌中尤為常見。針對EGFRvIII工程化的CAR-T細胞已被證明能有效殺死EGFRvIII陽性的肺癌細胞。這可能是預(yù)防手術(shù)后肺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在治療策略。
• 間皮素（MSLN）是一種細胞粘附糖蛋白，與肺癌患者的高腫瘤侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)。它被認為是包括肺癌在內(nèi)的實體瘤CAR-T療法的理想靶點。
• 黏蛋白1（MUC1）是一種跨膜蛋白，涉及癌細胞粘附和轉(zhuǎn)移。與正常肺組織相比，MUC1在肺癌組織中的表達顯著更高。它是肺癌CAR-T細胞療法的潛在靶點。
• 人表皮生長因子受體2（HER2）在肺癌中高度表達。它促進癌細胞的增殖、侵襲和血管生成。HER2可以作為肺癌診斷和治療的有希望的生物標志物。

3.3.乳腺癌

乳腺癌目前在全球女性癌癥中的發(fā)病率和死亡率最高。現(xiàn)有治療的耐藥性出現(xiàn)，強調(diào)了開發(fā)新療法的必要性。CAR-T細胞療法是一種利用患者免疫細胞對抗癌癥的免疫療法，已顯示出前景，并已廣泛應(yīng)用于血液惡性腫瘤。其在治療實體瘤，包括乳腺癌中的應(yīng)用勢頭增強。在乳腺癌細胞中，已鑒定出表達改變的特定分子作為CAR-T細胞療法的潛在靶點。十九種抗原，即HER2、EGFR、肝細胞生長因子受體/間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子（HGFR/cMET）、酪氨酸蛋白激酶跨膜受體（ROR1）、AXL受體酪氨酸激酶（AXL）、MUC1、MSLN、CD70、CD133、CD44v6、上皮細胞粘附分子（EpCAM）、軟骨素硫酸蛋白聚糖4（CSGP4）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、腫瘤內(nèi)皮標記8（TEM8）、滋養(yǎng)層細胞表面抗原2（TROP2）、葉酸受體α（FRα）、自然殺傷組2成員D（NKG2D）、GD2和癌胚抗原（CEA），已作為乳腺癌CAR-T細胞療法的靶點進行研究。這些抗原大多屬于受體酪氨酸激酶家族和細胞表面蛋白。研究表明，所有19種抗原都顯示出抗腫瘤效應(yīng)，抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)促炎細胞因子的釋放。

盡管近年來CAR-T細胞療法取得了進展，但仍存在幾項挑戰(zhàn)，包括不充分的轉(zhuǎn)移和滲透、免疫抑制環(huán)境的存在、缺乏腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原以及CAR-T細胞毒性。

盡管CAR-T細胞療法在乳腺癌方面取得了顯著進展，但由于支持證據(jù)不足，其在臨床設(shè)置中的應(yīng)用仍相距甚遠。為了加快CAR-T細胞療法在乳腺癌患者中的臨床實施，外泌體療法和臨床試驗對于解決安全問題和克服現(xiàn)有挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

3.4.血液學(xué)和非霍奇金淋巴瘤（NHL）治療

CAR-T細胞免疫療法在治療血液惡性腫瘤方面取得了顯著成功，在臨床試驗中觀察到高緩解率。針對CD19的CAR-T細胞顯示出對耐藥性B細胞惡性腫瘤的持久緩解效果，復(fù)發(fā)和難治性急性B淋巴細胞性白血病的治愈率已達到大約80-90%。

CAR-T療法在血液惡性腫瘤，如急性淋巴細胞性白血病和大B細胞淋巴瘤中的成功，徹底改變了它們的治療。FDA批準針對CD19的CAR-T細胞用于治療復(fù)發(fā)或難治性兒童和年輕成人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL），進一步驗證了這種方法的有效性。

CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤中的成功關(guān)鍵因素之一是存在單克隆疾病，其中單一靶抗原（如CD19）表達在所有腫瘤細胞表面。這使得CAR-T細胞能夠有效地靶向并消除癌細胞。為了克服這些挑戰(zhàn)，未來針對腫瘤的治療策略可能會涉及將基于免疫療法的治療，如CAR-T細胞療法，與其他治療方式相結(jié)合。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）最近批準的CD19特異性CAR-T細胞療法為化療耐藥性B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和復(fù)發(fā)/難治性兒童及年輕成人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）提供了有希望的治療。CD19是一個泛B細胞標記，在大多數(shù)B細胞NHL中高度表達，使其成為這些惡性腫瘤中CAR-T細胞療法的合適靶點。在急性淋巴細胞性白血�。ˋLL）的情況下，針對CD19的CAR-T細胞的臨床效果似乎比淋巴瘤更顯著。這可能是由于疾病生物學(xué)和治療反應(yīng)的差異。另一方面，外周T細胞淋巴瘤患者呈現(xiàn)一組異質(zhì)性疾病，通常預(yù)后較差，這對CAR-T細胞療法構(gòu)成了挑戰(zhàn)。

CAR-T細胞療法已從第一代發(fā)展到第二代CAR-T細胞。第一代CAR-T細胞使用CD3z鏈作為信號域，而第二代CAR-T細胞增加了額外的共刺激域以增強其抗腫瘤活性。第二代CAR-T細胞療法顯示出更顯著的抗白血病反應(yīng)，在復(fù)發(fā)B細胞ALL患者中高恢復(fù)率達到90%。然而，在具有高風險特征的個體中，如早期復(fù)發(fā)、難治性疾病和某些類型的淋巴瘤，治療結(jié)果仍然不佳。

目前，針對CD19的CAR-T細胞在約40%的化療耐藥性DLBCL、高級別B細胞淋巴瘤（HGBCL）和未經(jīng)前期治療的原發(fā)性縱隔B細胞淋巴瘤（PMBCL）患者中顯示出持續(xù)的緩解率。這些產(chǎn)品也用于至少經(jīng)過兩線前期治療后復(fù)發(fā)的侵襲性淋巴瘤患者。CAR-T細胞療法的進步為治療NHL患者提供了高效的解決方案。

3.5.前列腺癌

盡管在轉(zhuǎn)移性前列腺癌（mPCa）中使用CAR-T細胞療法的研究有限，但已對這種情況下CAR-T細胞療法的潛在靶點進行了研究。兩個重要的CAR-T細胞靶向抗原候選者是前列腺特異性膜抗原（PSMA）和前列腺干細胞抗原（PSCA）。體外和體內(nèi)模型表明PSMA-CAR-T細胞可以增殖并識別PSMA陽性細胞。第二代CAR-T細胞顯示出比前幾代更好的殺傷效果，代表了mPCa的一種新的免疫靶向方法。

在前列腺癌（PCa）中，已確定幾種蛋白質(zhì)由惡性細胞優(yōu)先表達，包括前列腺特異性抗原（PSA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺干細胞抗原（PSCA）、T細胞受體γ替代閱讀框蛋白（TARP）、瞬時受體電位（trp）-p8和前列腺特異性膜抗原（PSMA）。最近，各種研究探索了這些前列腺腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）作為在PCa患者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的靶點。

總的來說，轉(zhuǎn)移性前列腺癌中CAR-T細胞療法的使用是一個積極研究的領(lǐng)域，雖然已經(jīng)獲得了有希望的臨床前結(jié)果，但需要進一步調(diào)查以評估這種方法在臨床設(shè)置中的安全性和有效性。

3.6.膠質(zhì)母細胞瘤

外泌體的使用為CAR-T細胞技術(shù)在實體瘤治療中的應(yīng)用，包括針對特定區(qū)域的腫瘤，如膠質(zhì)母細胞瘤（GBM），帶來了希望。雖然CAR-T細胞療法在GBM中的探索還處于早期階段，但初步結(jié)果已經(jīng)顯示出使用這種方法的可行性、安全性甚至療效跡象。

在CAR-T細胞療法進一步開發(fā)用于GBM時，需要解決的幾個挑戰(zhàn)包括增強CAR T細胞對腫瘤的滲透、優(yōu)化輸注劑量和頻率、調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，以及解決GBM固有的分子異質(zhì)性。此外，與GBM的免疫療法相關(guān)的一般挑戰(zhàn)，如管理合并類固醇使用、區(qū)分真正的腫瘤進展與放射影像假進展，以及識別潛在的反應(yīng)生物標志物，需要在任何CAR-T細胞研究中考慮和解決。GBM的初始CAR靶標，如IL-13 Rα2、EGFRvIII和HER2，只是正在探索用于該疾病CAR靶向的潛在抗原的一些例子。針對ephrin-A2和EGFR的CAR-T細胞的臨床調(diào)查正在進行中，最近發(fā)現(xiàn)了新的抗原，如CD70。這些研究和其他研究的結(jié)果備受期待，以進一步推進我們對GBM CAR-T細胞療法的理解。

總之，盡管存在需要克服的挑戰(zhàn)，但早期結(jié)果已經(jīng)顯示出CAR-T細胞療法在GBM中的前景。正在進行的臨床調(diào)查和探索新的抗原作為CAR靶點為這一具有挑戰(zhàn)性的疾病提供了改善療法的希望。

3.7.CAR-T細胞和溶瘤病毒治療

CAR-T細胞和溶瘤病毒（OVs）已顯示出針對血液和實體腫瘤的潛力。然而，作為單一療法，它們的效果有限，特別是在實體腫瘤的情況下。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，癌癥基因治療領(lǐng)域一直在專注于開發(fā)包括化療、放療和其他免疫療法（如免疫檢查點抑制劑ICIs）在內(nèi)的聯(lián)合治療策略。

將CAR-T細胞和OVs結(jié)合起來可能改善各種類型癌癥患者的治療結(jié)果。通過整合兩種方法的優(yōu)勢，有潛力增強腫瘤靶向、免疫激活和治療效果。然而，需要進一步的研究和臨床試驗來評估這些聯(lián)合策略在更廣泛的癌癥類型和患者群體中的安全性、可行性和有效性。

3.8.CAR-T細胞療法的局限性

確實，為了充分發(fā)揮CAR-T細胞療法的潛力，需要解決幾個挑戰(zhàn)。其中一些挑戰(zhàn)包括理解腫瘤微環(huán)境。宿主腫瘤微環(huán)境在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，可能影響CAR-T細胞療法的效果。另一個挑戰(zhàn)是擴大CAR-T療法的適用性，因為需要使CAR-T療法可用于治療更廣泛的人類癌癥。這涉及識別和測試新抗原以及優(yōu)化CAR設(shè)計以針對特定類型的癌癥。此外，CAR-T療法目前成本高昂，對許多患者來說可能負擔不起。解決CAR-T細胞療法的定價和可負擔性問題是確保更廣泛獲取和可用性的關(guān)鍵。管理副作用是另一個問題；CAR-T細胞療法可能與副作用相關(guān)，如CRS、高燒、竇性心動過速、低血壓、低氧、神經(jīng)毒性、心臟功能抑制、其他器官功能障礙和移植物抗宿主�。℅VHD）。需要開發(fā)管理這些副作用的策略以提高患者安全和治療效果。

CAR-T細胞可能會經(jīng)歷耗竭和衰老，導(dǎo)致功能減弱和療效降低。理解和解決T細胞耗竭對于最大化CAR-T細胞療法的長期效果至關(guān)重要。

增強對免疫檢查點阻斷的反應(yīng)在癌癥治療中很重要。耗竭的T細胞可能會抑制效應(yīng)免疫并降低對免疫檢查點阻斷療法的反應(yīng)性。檢查點阻斷療法通過靶向調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)的免疫檢查點，在癌癥治療中取得了重大突破。一項研究探討了免疫檢查點阻斷的重要性以及耗竭T細胞在抑制效應(yīng)T細胞中的作用。這項研究重點關(guān)注了耗竭T細胞、針對程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的免疫檢查點阻斷和激進癌癥干細胞（CSCs）的產(chǎn)生和維持之間的關(guān)系。CSCs是腫瘤內(nèi)具有自我更新和腫瘤啟動能力的一小部分細胞，有助于腫瘤生長和治療抵抗。作者證明，對PD-1阻斷無反應(yīng)的終末耗竭CD8+T細胞在促進激進CSCs的產(chǎn)生和維持中扮演了重要角色。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中耗竭CD8+T細胞的存在導(dǎo)致CSCs上免疫檢查點分子（如PD-L1）的表達增加。這種耗竭T細胞和CSCs之間的相互作用導(dǎo)致效應(yīng)T細胞活性的抑制和增強CSC干細胞特性。

需要探索克服T細胞耗竭和增強對免疫檢查點抑制劑反應(yīng)的策略，以改善聯(lián)合療法的結(jié)果。

應(yīng)對這些挑戰(zhàn)將需要科學(xué)家、臨床醫(yī)生和行業(yè)合作伙伴之間的持續(xù)研究、創(chuàng)新和合作。盡管存在這些挑戰(zhàn)，對CAR-T細胞療法的日益增長的知識提供了寶貴的見解，可以指導(dǎo)該領(lǐng)域的進一步改進和進步。

4.CAR-T細胞衍生的外泌體的優(yōu)勢

CAR-T細胞療法存在局限性，包括強烈的毒性、抗原逃逸和腫瘤浸潤的限制。然而，CAR-T細胞衍生的外泌體（EVs）提供了一種更安全且潛在有效的免疫療法選擇，在癌癥研究中引起了興趣。這些外泌體可以定制攜帶各種貨物，如針對腫瘤的受體、小干擾RNA（siRNAs）或細胞因子，這些物質(zhì)增強了抗癌效果。CAR T細胞衍生的細胞外囊泡（EVs）的顯著益處包括安全性（無細胞性質(zhì)）、易于修改、可檢測性和癌癥的特異性。以下段落將進一步解釋這一點，并在表1中描述。

4.1.更可控的條件

與輸注CAR表達T細胞相關(guān)的最嚴重的副作用之一是CAR-T細胞誘導(dǎo)的CRS。CRS的癥狀包括惡心、頭痛、心動過速、低血壓、皮疹和呼吸急促。這些癥狀是由免疫細胞分泌細胞因子引起的。細胞因子風暴是一種嚴重的CRS，經(jīng)常導(dǎo)致低血壓和高燒，最終可能導(dǎo)致器官衰竭甚至死亡。幾乎三分之二的CAR-T細胞患者經(jīng)歷了CRS，通常出現(xiàn)在細胞輸注后10天。在最初的CAR-T細胞臨床試驗中，有兩例報告的死亡。這種潛在致命的后果主要與CAR-T細胞不受控制的細胞因子分泌有關(guān)。首先，由大量輸注的抗腫瘤淋巴細胞（高達10^11）釋放的細胞因子引起的全身性炎癥反應(yīng)類似于膿毒癥。如果細胞因子風暴導(dǎo)致心律失常、心臟驟停、肝衰竭或腎衰竭，接受者的生命可能處于危險之中。其次，CAR-T細胞可能會失控擴張，并表現(xiàn)為“活性藥物”，導(dǎo)致CRS。第二代和第三代CAR結(jié)構(gòu)中成本刺激受體如CD28、4-1BB、DPA10、OX40或ICOS的作用顯著提高了反復(fù)抗原暴露后的絕對T細胞增殖。例如，在慢性淋巴細胞性白血病患者中，4-1BB整合的CD19 CAR-T細胞在給藥后可以增殖超過1000倍。CAR-T細胞的體內(nèi)擴張被認為是必不可少的，并且與毒性和反應(yīng)有關(guān)。在重癥監(jiān)護室中，類固醇、升壓藥和IL-6阻斷劑以及支持性治療都已成功用于解決CRS相關(guān)問題。與傳統(tǒng)藥物引起的副作用不同，CAR-T細胞引起的毒性不能僅通過減少藥物劑量來控制。研究人員嘗試在CAR中加入自殺基因作為安全開關(guān)，以在極度毒性的情況下消除CAR-T細胞。這種策略涉及工程化CAR-T細胞，使其具有自殺基因，當出現(xiàn)不良反應(yīng)時可以激活以誘導(dǎo)細胞死亡。包括這個安全開關(guān)，允許及時和控制性地消除CAR-T細胞，最小化對患者的潛在傷害。CAR-T細胞衍生的外泌體有潛力被用作對癌細胞的直接攻擊，使這些“活性藥物”更容易控制。這是因為外泌體具有與CAR-T細胞相同的生物學(xué)特性。CAR-T細胞衍生的外泌體可以通過直接攻擊腫瘤來控制CAR-T細胞誘導(dǎo)的毒性，并取代對免疫細胞的需求（圖2）。Zitvogel及其同事的初步研究提供了這一理論。在他們的體內(nèi)研究中，用腫瘤肽脈沖的小鼠DC產(chǎn)生的外泌體導(dǎo)致了現(xiàn)有腫瘤的排斥。體外，DC產(chǎn)生的外泌體在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)方面與具有相似數(shù)量的DCs（0.5×10^6至1×10^6 DCs）的細胞一樣有效。Peters等人的早期研究表明，人類T細胞產(chǎn)生的外泌體在細胞毒性T淋巴細胞（CTL）與其靶細胞之間的相互作用中至關(guān)重要。CTL的表面膜分子，如T細胞受體（TCR）、CD3和CD8，存在于CTL衍生的外泌體中。這些分子允許外泌體特異性地靶向和殺死腫瘤細胞。當外泌體與腫瘤細胞結(jié)合時，外泌體上的TCR與腫瘤細胞的抗原/MHC復(fù)合物相互作用。這種相互作用觸發(fā)了外泌體與腫瘤細胞之間的共軛形成。然后共軛對外泌體和腫瘤細胞傳遞致命一擊，導(dǎo)致其死亡。外泌體對外泌體靶向的腫瘤細胞傳遞的致命一擊是由蛋白質(zhì)和其他分子的釋放引起的，包括穿孔素、顆粒酶和溶酶體酶。TCR激活刺激了CTL衍生的外泌體的產(chǎn)生，類似的工作已經(jīng)證明TCR/CD3復(fù)合物存在于人類CTL衍生的外泌體的膜中。

圖2 A. 腫瘤微環(huán)境（TME）以有限的血管形成、低氧水平（缺氧）和豐富的細胞外基質(zhì)成分為特征。缺氧可能會損害CAR-T細胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細胞的有效性。B. 一旦識別到腫瘤抗原，CAR T細胞通過釋放炎癥細胞因子啟動免疫反應(yīng)。這觸發(fā)免疫細胞產(chǎn)生大量細胞因子，導(dǎo)致一種稱為細胞因子釋放綜合征（CRS）的狀況。CRS主要是由激活的免疫細胞（包括T細胞、巨噬細胞（MQ）、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞（DC））釋放的眾多炎癥因子引起的全身性炎癥反應(yīng)。CRS的臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱和多個器官功能障礙。C. 外泌體與CAR-T細胞共享相似的特性，使它們成為控制CAR-T細胞誘導(dǎo)的毒性的潛在工具，通過直接靶向腫瘤并可能取代免疫細胞的需求。這些外泌體包含在T細胞上發(fā)現(xiàn)的表面膜分子，如T細胞受體（TCR）和CD8，使它們能夠選擇性地靶向并消除腫瘤細胞。外泌體與腫瘤細胞結(jié)合時，外泌體上的TCR與腫瘤細胞的抗原/MHC復(fù)合體相互作用，導(dǎo)致外泌體與腫瘤細胞之間形成共軛。這種共軛對外泌體和腫瘤細胞造成致命打擊，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。

與CAR-T細胞相比，CAR-T EVs和外泌體顯示出更低的毒性潛力。這使它們適合作為無細胞免疫療法劑，這可能簡化了監(jiān)管批準，因為它們可能不被歸類為先進治療藥物產(chǎn)品。此外，CAR-T外泌體具有低免疫原性，允許它們在第三方環(huán)境中作為現(xiàn)成產(chǎn)品使用。與親代細胞不同，EVs和外泌體可以輕松穿透腫瘤屏障，即使是在具有顯著纖維反應(yīng)的腫瘤中。研究表明，通過刺激生產(chǎn)細胞可以提高EV的產(chǎn)生和功能。在自體CAR生產(chǎn)中使用CAR-T EV療法消除了將腫瘤細胞重新引入患者的風險，這是CAR-T細胞療法的一個擔憂。已經(jīng)觀察到，殘留的腫瘤細胞可能無意中獲得CAR表達，導(dǎo)致對CAR-T細胞療法產(chǎn)生抗藥性。來自T淋巴細胞的EVs表達TCR和促凋亡分子，賦予它們細胞毒性和抗原特異性。這表明CAR-T細胞衍生的EVs可以有效傳遞促凋亡信號到癌細胞。然而，CAR分子在CAR-T細胞衍生的EVs上的存在對于誘導(dǎo)特定的癌細胞死亡至關(guān)重要，類似于它們的親代CAR-T細胞。通過優(yōu)化外泌體的釋放和表面CAR的表達，可以提高CAR表達外泌體的產(chǎn)生。TCR激活已被證明可以增加CTL衍生的外泌體的產(chǎn)生。另一方面，通過各種抗原刺激技術(shù)可以實現(xiàn)外泌體上更高水平的CAR表達。這些包括使用涂有重組CAR靶抗原的細胞珠或使用表達CAR抗原的細胞。這些策略可以幫助提高CAR表達外泌體產(chǎn)生的效果和效率。

盡管對CAR-T細胞衍生的外泌體的全面理解仍在研究中，但它們極有可能將抗原靶向的細胞毒性傳遞給癌細胞。這是因為它們表面含有可以與癌細胞結(jié)合的靶向分子，以及可以殺死癌細胞的細胞毒性分子。

4.2.直接攻擊者

CAR-T細胞療法在治療實體瘤方面的效果不如淋巴惡性腫瘤。多種癌癥的腫瘤微環(huán)境可能會干擾CAR-T細胞的抗癌功能，除了用于CAR構(gòu)建的腫瘤抗原的特異性。CAR-T細胞與腫瘤細胞之間的細胞間相互作用是這種抗癌方法的關(guān)鍵需求。然而，實體瘤具有豐富的基質(zhì)，CAR-T細胞必須穿透，這與淋巴惡性腫瘤不同。至少有兩種方式，實體瘤微環(huán)境限制了CAR-T細胞的有效性。首先，CAR-T細胞的功能可能受到腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的限制。腫瘤微環(huán)境通過影響CAR-T細胞的體外操作后的T淋巴細胞功能，從而干擾CAR-T細胞的效力的第二種機制。這可能使它們難以穿透實體瘤的細胞外基質(zhì)（ECM）。Caruana等人提供了支持上述機制的直接證據(jù)。ECM的主要成分，肝素硫酸蛋白聚糖，被酶肝素酶（HPSE）降解，該酶被設(shè)計為在CAR-T細胞上表達。HPSE CAR-T細胞減少ECM的能力被證明有助于腫瘤T細胞浸潤，并最終提高抗癌效力。然而，由于它們的納米級大小，CAR-T細胞產(chǎn)生的外泌體可以用作直接的癌癥吸引劑，這可能有助于CAR介導(dǎo)的抗癌療法。從CAR-T細胞產(chǎn)生的外泌體必須能夠作為直接攻擊者，并且能夠針對特定的抗原靶向腫瘤位置，以替代抗癌療法中的CAR-T細胞。與需要治療性細胞主動移動到目標部位的基于細胞的療法不同，無細胞外泌體可以通過生物液體如血液循環(huán)傳遞。外泌體能夠穿越生物屏障，包括腫瘤血液屏障（BTB）和血腦屏障（BBB）。這一事實得到了支持，即在體液中發(fā)現(xiàn)了源自腫瘤細胞的外泌體。此外，靜脈注射的外泌體被腫瘤的高度保留效應(yīng)和滲漏的血管系統(tǒng)推向腫瘤。據(jù)報道，外泌體在體內(nèi)被動傳輸，但它們的目標導(dǎo)向分布主要受其表面組織特異性受體的影響，這些受體源自親代細胞。外泌體可以通過將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到目標細胞來殺死癌細胞。這可以通過三種不同的機制發(fā)生。首先，通過直接接觸，外泌體可以與目標細胞表面的特定受體結(jié)合，觸發(fā)促進細胞死亡的信號級聯(lián)。這種相互作用可以激活誘導(dǎo)凋亡的途徑或刺激針對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)。其次，外泌體可以與目標細胞的質(zhì)膜融合，導(dǎo)致生物活性分子（如蛋白質(zhì)和核酸）轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。這些轉(zhuǎn)移的組分可以破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，啟動凋亡途徑或干擾關(guān)鍵的細胞過程。最后，外泌體可以通過內(nèi)吞作用被目標細胞內(nèi)化，允許其貨物釋放到細胞內(nèi)空間。外泌體的內(nèi)容物，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，然后可以發(fā)揮細胞毒性作用，觸發(fā)程序性細胞死亡或調(diào)節(jié)細胞功能。這三種機制共同展示了外泌體如何有效地介導(dǎo)殺死腫瘤細胞并促進抗癌反應(yīng)。

4.3.靶向特異性

CAR結(jié)構(gòu)中的抗體衍生的單鏈可變片段（scFv）控制CAR-T細胞的靶向特異性。靶向攻擊屬性依賴于CD19特異性scFv在使用CD19-CAR-T細胞治療CD19陽性血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療方法中。正常器官或組織中也表達相同的抗原，這就是所謂的“靶向腫瘤外”的影響。細胞膜蛋白，如參與細胞靶向的蛋白，可能在生物發(fā)生過程中被運輸?shù)酵饷隗w。根據(jù)Muntasell等人的研究，在24小時內(nèi)，B細胞表面結(jié)合的肽-MHC II復(fù)合物中有12%被內(nèi)吞、運輸?shù)蕉嗯蒹w，并在外泌體上釋放。

親代細胞的外泌體很可能能夠傳遞靶向特性。許多臨床前研究支持了這一觀點，盡管對CAR-T細胞制造的外泌體還需要更多的研究。Alvarez-Erviti等人在他們的研究中提供了針對性外泌體的直接證據(jù)。他們通過基因修飾樹突狀細胞表達Lamp2b，這是一種與神經(jīng)元特異性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽段相關(guān)的外泌體膜蛋白，成功制備了針對小鼠大腦的外泌體。然后他們使用這些外泌體作為向大腦輸送siRNA的遞送系統(tǒng)。RVG的可用性，作為一種配體，精確地與神經(jīng)元中的乙酰膽堿受體結(jié)合，決定了它們在系統(tǒng)遞送后如何精確地分布到神經(jīng)元。由于間充質(zhì)干細胞（MSCs）對原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤部位的偏好，MSC介導(dǎo)的抗癌方法成為廣泛研究的主題。與細胞對應(yīng)物相比，CAR-T外泌體提供了幾個有希望的優(yōu)勢，包括高靶向特異性、對PD-L1免疫抑制不敏感，以及降低誘發(fā)細胞因子釋放綜合征的風險。來自靶向間皮素（MSLN）的CAR-T細胞的外泌體也觀察到了類似的鼓舞人心的結(jié)果。這些外泌體通過分泌穿孔素和顆粒酶B，有效地靶向MSLN陽性和三陰性乳腺癌細胞，展示了它們的效率。重要的是，在BT-549和MDA231-MSLN異種移植乳腺癌腫瘤模型中進行的體內(nèi)研究表明，具有低毒性的顯著抗腫瘤效果。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了CAR-T外泌體作為一種有前途的癌癥治療方法的潛力。

腫瘤衍生的生物因子和MSCs中匹配受體的存在是MSCs能夠進行腫瘤定向歸巢的必要條件。腫瘤通常被描述為“永不愈合的傷口”，因為它們是細胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的持續(xù)來源。然而，MSCs表達多種生長因子的受體，如PDGF和IGF-1，以及趨化因子受體，包括CCR2、CCR3、CCR4和CCL5[101]。值得注意的是，所有表面標志物、信號分子和細胞粘附分子也存在于MSC衍生的外泌體中，這表明外泌體可能采用親代細胞的歸巢模式，并獲得與其親代細胞相同的一系列表面受體和相關(guān)結(jié)合蛋白。

這種天然的趨向性表明，選擇理想的細胞來源進行器官特異性治療方法的外泌體衍生是至關(guān)重要的。然而，工程化的CARs可以提供非HLA限制的細胞表面成分識別，并不依賴于HLA進行抗原處理和呈遞。因此，CAR-T更廣泛地適用于具有多樣化HLA的患者群體。

4.4.適應(yīng)癌癥的復(fù)雜性和變化

除了賦予CAR-T細胞抗原特異性靶向能力外，工程化的CARs還增強了CAR-T細胞的生長和細胞因子產(chǎn)生。細胞因子是最直接的攻擊者，在CAR-T細胞內(nèi)（主要是白細胞介素，如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21）顯著擴大。然而，由于癌組織極度異質(zhì)，癌細胞高度適應(yīng)，這是藥物抗性的基礎(chǔ)，沒有特定的攻擊者或藥物能夠有效治療任何特定的癌癥。在藥物治療開始之前，幾乎所有癌癥病例中近50%存在對化療的內(nèi)在抗性，而在剩余的50%癌癥病例中，獲得性抗性發(fā)生在相當一部分中。由于癌細胞的巨大異質(zhì)性和復(fù)雜生物學(xué)特性，表現(xiàn)出廣泛的個體變異，迄今為止所有克服化療抗性的嘗試都失敗了。這可能是CD19-CAR-T細胞療法在CD19+B細胞白血病患者中成功有限的原因。理想的抗癌策略應(yīng)該是多樣化的，并能夠同時采取行動，考慮到癌癥的異質(zhì)性和可變性。抗癌藥物也可以根據(jù)患者的獨特情況進行調(diào)整。事實上，CAR-T細胞和CAR-T細胞衍生的外泌體提供了執(zhí)行上述修改的有利平臺。

通過CAR-T細胞，可以間接添加額外的抗癌藥物。外泌體通過從親代細胞向受體細胞運輸各種信息，包括蛋白質(zhì)、mRNAs、ncRNAs和miRNAs，作為細胞間通信的手段。外泌體和親代細胞都含有絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)、mRNAs和miRNAs。細胞外蛋白酶和RNases防止外泌體攜帶的蛋白質(zhì)和RNAs降解，延長它們的半衰期，并增強它們的生物活性。根據(jù)小鼠的臨床前研究，從用腫瘤肽脈沖的DCs中分離出的外泌體能夠在體內(nèi)啟動特定的細胞毒性T淋巴細胞，并以T細胞依賴的方式抑制已建立的小鼠腫瘤的生長，展示了從親代細胞到外泌體的刺激誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)移的操縱。以前已經(jīng)顯示，當HepG2（肝癌細胞）和ASPC-1（胰腺癌細胞）暴露于用抗癌基因TRAIL工程化的MSCs的條件培養(yǎng)基（CM）時，它們具有顯著的細胞毒性。

由MSCs產(chǎn)生的外泌體可能在將抗癌劑從MSCs運輸?shù)桨┘毎�中起著至關(guān)重要的作用。因為TRAIL表達載體被用于這種抗癌基因工程，TRAIL通過外泌體的遞送可能以cDNA、mRNA或蛋白質(zhì)的形式進行。研究表明，使用心肌梗死模型，體外培養(yǎng)的基因修飾MSCs的CM在預(yù)防心室重塑方面的效果與細胞移植相當。一個或多個癌細胞攻擊者可能在體外擴增的CAR-T細胞中外泌體的生物合成過程中被間接加載。之后，根據(jù)患者的治療情況，可以替換多個和額外的攻擊者，當與內(nèi)在的T淋巴細胞細胞因子結(jié)合時。

此外，抗癌藥物可以直接裝載到由CAR-T細胞制成的外泌體中。外泌體可能包含親水性和疏水性物質(zhì)，因為它們類似于脂質(zhì)體，也具有水核心和雙脂膜。對于像mRNA、siRNA和miRNA這樣的親水性分子，可以通過短暫的物理（例如，電穿孔）或化學(xué)（例如，脂質(zhì)體介導(dǎo)）破壞外泌體膜來實現(xiàn)外泌體裝載。在Alvarez-Erviti等人的研究中，通過電穿孔將外源siRNA直接裝載到樹突狀細胞衍生的外泌體中，這導(dǎo)致了目標細胞中目標基因的mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)。然而，短暫的直接共孵育可以使外泌體裝載疏水性分子。

通過外泌體傳遞的抗癌基因產(chǎn)物更容易使用，因為它們充當納米載體。P53、Myc和磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）是大多數(shù)抗癌基因產(chǎn)物影響腫瘤細胞的細胞內(nèi)機制的例子。在間充質(zhì)干細胞（MSC）介導(dǎo)的基因治療領(lǐng)域，MSC被用作傳遞抗癌基因的載體。細胞內(nèi)的抗癌基因產(chǎn)物需要在MSC中產(chǎn)生并分泌到細胞外空間，然后它們需要穿透附近的腫瘤細胞，通過生物膜，這是大多數(shù)大分子的自然屏障，包括肽和蛋白質(zhì)。因此，相關(guān)表達載體的構(gòu)建通常包含一個前導(dǎo)序列和一個轉(zhuǎn)錄激活因子（TAT）。然而，外泌體已被證明可以穿過血漿膜以將貨物傳遞給受體細胞。例如，來自樹突狀細胞的外泌體可以將裝載有肽段的MHC I和II復(fù)合體傳遞給其他樹突狀細胞和CD4+T細胞以控制免疫反應(yīng)。來自親本細胞的mRNA和蛋白質(zhì)可以直接轉(zhuǎn)移到受體細胞的細胞質(zhì)中，避免了生物膜。從理論上講，通過外泌體生物發(fā)生，基因工程化的MSC可以以所有可能的形式傳遞抗癌基因產(chǎn)物，包括cDNA、mRNA和蛋白質(zhì)。這可能解釋了分泌TRAIL和非分泌TRAIL的工程化MSC誘導(dǎo)的癌細胞死亡之間缺乏區(qū)別。顯然，外泌體將擴展和改善基于細胞的基因治療在癌癥治療中的應(yīng)用，正確應(yīng)用的話。CAR T細胞衍生的外泌體對腫瘤細胞的一些治療潛力在表2中總結(jié)。

5.結(jié)論

利用經(jīng)過基因改造表達CAR的T淋巴細胞，基于CAR的過繼性免疫療法可以引發(fā)既是T細胞介導(dǎo)的，又是針對目標抗原的特異性免疫反應(yīng)。輸注到體內(nèi)后，CAR-T細胞作為“活藥”持續(xù)對預(yù)期的惡性細胞發(fā)起細胞毒性攻擊。它們自己的壽命和體內(nèi)未來的擴展決定了它們強大的腫瘤殺傷能力將持續(xù)多久。然而，不可能充分控制CAR-T細胞釋放的細胞因子量或這些細胞的體內(nèi)擴展狀態(tài)，這是CRS、細胞因子風暴和“靶向腫瘤外”反應(yīng)等不良事件的潛在來源。

由CAR-T細胞制成的外泌體具有巨大的治療潛力，因為它們可以取代CAR-T細胞，瞄準腫瘤細胞。外泌體可以作為癌癥治療的直接對手，取代CAR-T細胞，由于它們的無細胞性質(zhì)和生物學(xué)特性，具有明顯的優(yōu)勢。首先，使用外泌體作為“現(xiàn)成”試劑使CRS可控。外泌體的適當使用也為CAR-T技術(shù)治療實體瘤鋪平了道路，包括由于它們的納米尺寸而針對特定區(qū)域的腫瘤，如膠質(zhì)母細胞瘤。第三，除了CAR-T細胞的內(nèi)在細胞因子外，還可以向CAR-T細胞衍生的外泌體中添加額外的攻擊者以防止?jié)撛诘目顾幮�，第四，這兩種平臺（即CAR-T細胞和CAR-T細胞衍生的外泌體）的聯(lián)合和/或交替使用無疑將加強基于CAR的癌癥治療的應(yīng)用。

根據(jù)圖3所示的在臨床環(huán)境中使用CAR-T細胞衍生的外泌體的提出方法，收集癌癥患者的外周血T細胞，將CAR通過病毒或非病毒方式插入T細胞，體外擴展CAR工程化的T細胞，分離外泌體，然后給患者外泌體�；�于外泌體的獨特特性，如大�。�30-150納米）、密度（1.1-1.18 g/ml）和進化上保守的蛋白質(zhì)分子集合（CD9、CD63、CD81、Alix和Tsg101），可以從培養(yǎng)基中使用多種技術(shù)分離CAR-T細胞衍生的外泌體，包括超濾、超速離心和抗體偶聯(lián)磁珠上的親和捕獲。

圖3 目標識別的進展、提高腫瘤穿透性、毒性管理以及研究聯(lián)合療法為CAR-T細胞療法成功應(yīng)用于實體瘤提供了樂觀的前景。這些進步使我們更接近于個性化和精準的癌癥治療。收集癌癥患者的外周血樣本以分離總的有核細胞。然后，在存在T細胞刺激因子（如CD3和CD28抗體）的條件下培養(yǎng)這些細胞。通過病毒或非病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)引入嵌合抗原受體（CARs）對選定的CD8+T細胞進行遺傳修飾。進一步擴展CAR工程化的T細胞。從CAR-T細胞中分離出外泌體。最后，在化療預(yù)處理后，將分離出的外泌體重新輸回同一患者體內(nèi)。

在使用CAR-T細胞衍生的外泌體進行任何臨床設(shè)置之前，確實有必要進行臨床前研究以對它們進行表征。總之，一種有希望的癌癥治療方法是基于CAR的T細胞過繼性免疫療法。作為一種前沿且有效的治療方法，由于癌癥的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，它正遇到一些缺陷或限制。從CAR-T細胞衍生的外泌體可能取代CAR-T細胞，作為終極攻擊者，作為這種有效方式的延伸，從而克服當前治療模型中的一些缺點。通過適當整合細胞和外泌體平臺，這種有效的治療方法將變得更加功能強大，并應(yīng)使我們更接近于創(chuàng)造一種新的針對性癌癥治療選擇。

此外，作為未來發(fā)展，我們可以參考選擇性地裝載所需的mRNA或控制目標基因裝載在外泌體中。最近的研究提出了選擇性裝載mRNA或控制目標基因裝載到外泌體中的策略。這包括工程化供體細胞、修改外泌體表面和使用合成納米顆粒。未來的進展旨在增強特定轉(zhuǎn)錄物的靶向和整合，提高穩(wěn)定性，并優(yōu)化裝載效率。創(chuàng)新的基因遞送系統(tǒng)和識別外泌體和受體細胞上的具體標記可以實現(xiàn)精確的貨物遞送。這些發(fā)展為精準醫(yī)療和基因治療等治療應(yīng)用帶來了希望。