分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)及其在疾病治療上的應(yīng)用前景

作者：WuXi AppTec 文章來源：藥明康德賦能前沿

分子膠（Molecular Glue）是一類小分子化合物，它能夠通過改變目標(biāo)蛋白質(zhì)的表面特性以促進(jìn)或誘導(dǎo)其與其他蛋白的蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）。通過誘導(dǎo)PPI的產(chǎn)生，分子膠可以實現(xiàn)特定的生物學(xué)功能，如蛋白降解、通路抑制或激活。作為一種具有創(chuàng)新性的藥物候選化合物，它具有較高的靶向性和生物利用度，且能夠在特定的環(huán)境條件下控制藥物的釋放。因此，分子膠憑借其獨特的特性在糖尿病、心血管疾病、眼科疾病以及癌癥的治療上展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

1. 分子膠藥物與靶向蛋白降解

大多數(shù)疾病的發(fā)生都與蛋白或者信號通路的激活或抑制有關(guān)，而在這些過程中均涉及到大量的蛋白-蛋白相互作用。因此，人為地操控PPI成為了調(diào)控蛋白生物學(xué)功能、治療相關(guān)疾病的新型策略。

目前，分子膠藥物最廣泛的應(yīng)用是誘導(dǎo)蛋白的降解: 通過改變靶蛋白或者E3連接酶的表面，誘導(dǎo)PPI，進(jìn)而形成“靶蛋白-分子膠-E3連接酶”的三元復(fù)合物，并誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，最終使靶蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。在已成功上市的分子膠藥物中，沙利度胺，來那度胺等免疫調(diào)節(jié)藥物均是通過誘導(dǎo)靶蛋白降解達(dá)到治療效果[1]。近些年來，更是有大量藥企加碼靶向蛋白降解（Target protein degradation, TPD）的分子膠藥物研發(fā) (圖1)。

圖1. 分子膠研發(fā)歷史及代表性藥物[1]

目前市場之所以關(guān)注靶向蛋白降解的治療策略，并選擇分子膠作為降解劑，一方面是由于TPD藥物的特殊機(jī)制，使其相比傳統(tǒng)小分子藥物能夠靶向更廣泛的蛋白，包括一些難以成藥的支架蛋白、毒性蛋白等。另一方面，分子膠在眾多TPD技術(shù)中有著獨一無二的優(yōu)勢。與PROTAC進(jìn)行對比，分子膠具有更好的理化性質(zhì)、無Hook效應(yīng)、對親和力的要求也相對較低等優(yōu)勢（圖2），這些優(yōu)點均為分子膠的藥物提供了極大的臨床潛力。但是不能忽視的是，相比之下，PROTAC類的靶向嵌合體更容易進(jìn)行理性設(shè)計，而分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)則較為困難。

圖2. 分子膠與PROTAC的對比[2]

2、分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)
目前分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)方式可以概括為三種：偶然發(fā)現(xiàn)、篩選或信息學(xué)和理性設(shè)計（藥化修飾）[3,4,5]。雖然已有不少較為積極的例子，但是分子膠的發(fā)現(xiàn)依然面臨許多挑戰(zhàn)。由于需要誘導(dǎo)蛋白與蛋白的相互作用，該過程往往涉及蛋白的構(gòu)象變化，這使得分子膠藥物的早期發(fā)現(xiàn)通常具有較低的命中率，同時也使得分子膠的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（Structure-Activity Relationship，SAR）分析，或者進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥化設(shè)計變得更加困難。此外，化合物對化學(xué)修飾的敏感度也非常高。面對這一系列的挑戰(zhàn)，目前主流的策略是通過較大規(guī)模的篩選來實現(xiàn)苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)。

綜合分子膠發(fā)現(xiàn)的多種策略，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺早期研發(fā)團(tuán)隊搭建了一套分子膠發(fā)現(xiàn)平臺，以賦能分子膠藥物的發(fā)現(xiàn)。該平臺主要包括DNA編碼化合物庫篩選（DNA Encoded Library Screening，DEL ）、親和質(zhì)譜篩選（Affinity Screen Mass Spectrometry，ASMS）和高通量篩選（High Throughput Screen，HTS）三種不同的方法（圖3）。

圖3. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺—分子膠篩選平臺

2.1 DEL篩選
DNA編碼化合物庫是基于組合化學(xué)構(gòu)建的小分子化合物庫，每種化合物有著獨一無二的DNA編碼進(jìn)行標(biāo)記。DEL庫擁有超大的化合物多樣性，極低的單個分子合成成本，并且能夠提供豐富的SAR信息。DEL庫的一般采取親和力篩選，因此非常適用于分子膠的發(fā)現(xiàn)（圖4）。

圖4. DEL篩選能力平臺賦能分子膠發(fā)現(xiàn)

針對分子膠藥物發(fā)現(xiàn)，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺早期研發(fā)團(tuán)隊可以提供兩類不同類型的DEL庫：一種是多樣性化合物庫，該系列化合物庫擁有超過200個不同合成路線的子庫，包含超過50億種不同結(jié)構(gòu)的化合物。在設(shè)計和合成這些化合物的過程中，建庫團(tuán)隊通過總結(jié)和整理已經(jīng)上市或在研的化合物，提煉了超過6000個不同的生物活性結(jié)構(gòu)，用于庫的構(gòu)建。這種高度多樣性的庫提供了新穎的結(jié)構(gòu)和廣闊的化學(xué)空間，適用于針對一些尚無分子膠或小分子配體報道的靶點篩選。

另一種是分子膠Focus庫，這類化合物庫根據(jù)已報道的小分子配體或分子膠的核心骨架進(jìn)行設(shè)計，在設(shè)計過程中進(jìn)行基于逆合成分析的結(jié)構(gòu)功能性拆分，使用大量的化學(xué)修飾，極大地擴(kuò)展核心骨架的化學(xué)空間。這類庫的特點是具有很強(qiáng)的靶點針對性，成功率也會更高。目前，藥明康德早期研發(fā)平臺已經(jīng)設(shè)計并合成了E3連接酶Cereblon (CRBN)的分子膠Focus庫。CRBN分子膠的溶劑暴露區(qū)是誘導(dǎo)PPI和產(chǎn)生選擇性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，針對這部分結(jié)構(gòu)，庫設(shè)計團(tuán)隊采用多樣性的合成砌塊進(jìn)行修飾，通過多條合成路線，平行開發(fā)了in-solution DEL和固載在Beads上的on-bead DEL，最終得到了擁有約六百萬種化合物的Focus庫。對于已有分子膠或者小分子配體報道的靶點，選擇這類庫可以有效提高篩選的數(shù)據(jù)表現(xiàn)和成功率（圖5）。

圖5. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺的分子膠DEL庫

在對分子膠DEL庫進(jìn)行篩選時，根據(jù)DEL庫的不同形式（in-solution或on-bead）會采用不同的方法。針對in-solution DEL，主要采用“Single pull-down & Single Reaction”的方式進(jìn)行親和力篩選，通過對比單一蛋白孵育和雙蛋白孵育條件的富集度的比值（Enrichment fold change）來尋找能誘導(dǎo)并形成三元復(fù)合物的分子膠苗頭化合物。這個過程中，更高的Enrichment fold change會表明該化合物的富集更依賴于兩個蛋白的同時存在（圖6）。

圖6. In-solution DEL的Single Pull-down & Single Reaction篩選方法

藥明康德分子膠篩選平臺首先使用已報道的GSPT1/CRBN分子膠CC-885作為工具分子和上文提到的多樣性DEL庫一同進(jìn)行篩選。我們將CC-885連接上DNA后混入多樣性DEL化合物庫中。結(jié)果表明，CC-885的on-DNA 工具分子在GSPT1和CRBN蛋白同時孵育的條件中，富集度遠(yuǎn)高于單一蛋白孵育的條件。同時，在該篩選后我們也發(fā)現(xiàn)了很多CRBN潛在配體，并找到了一些高富集度、且雙蛋白條件富集度高于單蛋白條件的分子。隨后我們通過HTRF實驗對這些分子進(jìn)行了驗證，發(fā)現(xiàn)了有潛在分子膠活性的小分子（圖7）。

圖7. GSPT1/CRBN分子膠的In-Solution DEL篩選

與in-solution DEL不同，on-bead DEL則會同時與兩種蛋白孵育，隨后通過加入能夠特異性識別兩種蛋白的熒光抗體進(jìn)行篩選。由于beads的大小適配流式細(xì)胞儀的檢測方法，兩種熒光抗體就會在分選時被APC或者FITC channel檢測到。我們通過對APC(+),FITC(+)的篩選后樣品進(jìn)行DNA測序解析，就能找到潛在的分子膠化合物。通過使用CDK12-CyclinK/DDB1分子膠CR-8作為tool compound，與該靶點的negative compound混合后進(jìn)行篩選驗證，F(xiàn)ACS明顯的顯示大量CR-8的信號在APC(+),FITC(+) channel中被檢測到，而只用negative compounds或者空白beads的組別在該channel則幾乎沒有信號被檢測到。這些結(jié)果證明了藥明康德分子膠篩選平臺開發(fā)的兩種DEL篩選方法能夠有效地找到分子膠苗頭化合物，助力分子膠藥物發(fā)現(xiàn)（圖8）。

圖8. CDK12-CyclinK/DDB1分子膠的on-bead DEL驗證

2.2 ASMS篩選
親和力質(zhì)譜篩選是一種用途廣泛的親和力篩選方法。與DEL篩選不同，ASMS篩選的小分子并未連接在DNA上，而是常規(guī)的小分子。目前，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺擁有大小超過27萬的小分子化合物庫，均可以用于分子膠的篩選。這些化合物包含供應(yīng)商來源以及藥明康德內(nèi)部的一些化合物。團(tuán)隊對這些化合物進(jìn)行了嚴(yán)格的篩選和過濾，以保證它們具有良好的理化性質(zhì)和廣闊的化學(xué)空間。

分子膠的ASMS篩選方法與in-solution DEL的篩選類似，篩選條件設(shè)置雙蛋白和單蛋白兩種，最終通過雙蛋白和單蛋白兩個條件的信號響應(yīng)值對比來篩選出潛在的分子膠分子。

在對CDK12-CyclinK/DDB1進(jìn)行ASMS分子膠篩選的過程中，篩選團(tuán)隊從藥明康德27萬的小分子庫中隨機(jī)挑選使用了1000個分子，經(jīng)過ASMS篩選、Dose-response的ASMS驗證、二元復(fù)合物結(jié)合測試（SPR）、三元復(fù)合物結(jié)合測試（SPR、HTRF）等一系列實驗，發(fā)現(xiàn)和驗證了兩個分子膠苗頭化合物（圖9）。

圖9. CDK12-CyclinK/DDB1分子膠的ASMS篩選

2.3 HTS篩選
HTS篩選是苗頭化合物發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)方法。藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺的高通量篩選不僅包括分子膠親和力篩選，也包含基于活性（功能性或半功能性）的分子膠篩選。和ASMS篩選一樣，高通量篩選也主要使用藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺建立的27萬種小分子庫進(jìn)行篩選。并已開發(fā)了常用的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，TR-FRET）等一系列成熟的篩選方法。

3. 分子膠苗頭化合物的驗證
藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺早期研發(fā)團(tuán)隊不僅擁有分子膠藥物發(fā)現(xiàn)方面的能力，也擁有蛋白質(zhì)科學(xué)、以及化合物驗證等相關(guān)能力, 形成了分子膠研發(fā)的完備Toolbox（圖10）。在蛋白質(zhì)科學(xué)方面，對于TPD研究必不可少的E3連接酶蛋白，團(tuán)隊擁有大量的現(xiàn)貨蛋白和成熟、高成功率的生產(chǎn)經(jīng)驗，以及配套的X射線晶體學(xué)能力。此外，在篩選后的驗證能力，藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺擁有多種生物物理和生物化學(xué)的方法來進(jìn)行二元和三元復(fù)合物的結(jié)合驗證，以及HiBit和Western blot等降解活性檢測方法，以驗證這些潛在化合物是否能在細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)生物學(xué)功能。

圖10. 藥明康德生物學(xué)業(yè)務(wù)平臺服能分子膠藥物研發(fā)

參考文獻(xiàn)：
[1] Chem. Soc. Rev. 2022, 51, 5498–5517.
[2] Biochemistry. 2023, 62, 601−623.
[3] Science. 2017, 356, eaal3755.
[4] J. Med. Chem. 2021, 64, 1835−1843.
[5] J. Med. Chem. 2021, 64, 10606−10620.