工藝開發(fā)及優(yōu)化：下游蛋白質純化技術的實踐與方案

蛋白質純化技術，是生物下游技術中非常重要的組成部分，掌握蛋白質純化技術的基本理論與操作，對相關專業(yè)學生的繼續(xù)深造以及就業(yè)發(fā)展均有重要作用^【1】。重組蛋白的表達（尤其是使用細菌載體和宿主）是一項成熟的技術。難點在于如何將其以活化形式分離。
 
利用基因工程技術生產重組蛋白一般可以分為上游、中游和下游三個部分。上游技術指包括基因重組與克隆，工程菌的構建與表達等在內的重組DNA技術，中游技術主要指工程菌或細胞的發(fā)酵技術，而下游技術則是指重組蛋白的分離純化技術^【2】。

蛋白質在細胞中一般以復雜的混合物形式存在，且不同的蛋白質物理化學性質差異很大。
 
因此，到目前為止，還沒有一個完全固定的方法能把任何一種蛋白質從復雜的混合物中分離純化出來^【2】。不同的重組蛋白具有不同的氨基酸序列和空間結構，導致其物理、化學和生物學特性存在差異。我們也可以根據(jù)目標蛋白與其他蛋白和裂解液的性質差異設計合理的蛋白純化方案。
 
一般來說蛋白質的純化可以分為3個連續(xù)的階段：捕獲，中度純化和精細純化（如下圖所示）。當然在純化步驟之前通常還需要提取、澄清和濃縮最初的細胞裂解物^【2】。
   
重組蛋白的純化是生物學研究中的重要技術。為了研究蛋白的特定功能和結構，研究人員必須將重組蛋白從生物體中分離并純化。蛋白純化方法主要利用不同重組蛋白之間的相似性和差異性�？梢愿鶕�(jù)蛋白之間的相似性去除非蛋白物質，然后根據(jù)蛋白之間的差異分離純化目標重組蛋白。
 
由于組成蛋白質的氨基酸種類、數(shù)目、序列以及折疊形式各不相同，因此表達的重組蛋白物理和化學性質差異很大，而重組蛋白的分離純化就是利用這種性質上的差異，從而將目標蛋白從細胞或培養(yǎng)液中分離純化出來。蛋白質純化過程 中常用的蛋白性質包括：大小、形狀、荷電性、等電點、疏水性、溶解度、密度、與配體結合能力、與金屬鰲合能力以及某些特殊性質（如耐熱性 、抗蛋白酶）等。以這些性質為基礎，人們己經開發(fā)了多種用于蛋白質分離純化的方法。具體見表所示^【2】。
  層析技術又稱色譜，是目前使用最廣泛的，同時也是最可靠的蛋白質分離純化方法。其是基于樣品在固定相與流動相中的分配差異，從而實現(xiàn)目標蛋白分離純化的方法，具有分離效率高、適用性廣、易于放大等優(yōu)點。常用的層析技術主要包括五大類：凝膠過濾層析、疏水作用層析、離子交換層析、親和層析以及反相層析，各層析技術原理如圖所示。近年來隨著技術的進步，人們又在傳統(tǒng)層析技術的基礎上，開發(fā)了兼有多種模式的混合模式層析技術以彌補傳統(tǒng)層析技術在某些方面的不足，其中，疏水電荷誘導層析是最具代表性的新型混合模式層析技術，具有廣泛的應用價值^【2】。
 
純化技術的選擇與組合是對蛋白質進行成功純化的關鍵，其最終目的就是經過合理設計與優(yōu)化，能使獲得高收率、高純度以及低成本的目標蛋白純化工藝。近年來，雖然有學者報道通過采用計算機為基礎的專家系統(tǒng)來預測和優(yōu)化純化工藝，但由于蛋白質的復雜性，該方法還很難用于實際蛋白質的分離純化過程。因此，目前人們在制定純化方案時往往還是單純根據(jù)經驗或實驗來選擇與組合純化技術。
  原核表達體系
 
真核表達體系
   

中度純化-MaXtar^® Q陰離子層析
 

精細純化-CHT復合模式層析
 


參考文獻
[1]辛瑜.《蛋白質純化技術》理論與實驗課程教學探索[J].教育教學論壇,2019,(47):269-270.
[2]侯率.重組蛋白A的分離純化工藝研究[D].大連理工大學,2011.
[3]GE公司.離子交換色譜及色譜聚焦原理和方法[M]

 

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