胰蛋白酶殘留檢測的必要性和常見檢測方法

胰蛋白酶 (Trypsin) 是一種由胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶。它能夠特異性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基羧基端的肽鍵，將蛋白質(zhì)分解為較小的多肽或氨基酸，從而參與食物中蛋白質(zhì)的消化以及體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)等生理過程。

胰蛋白酶的應(yīng)用：

細(xì)胞培養(yǎng)：

1. 細(xì)胞解離：胰蛋白酶能分解細(xì)胞間的粘連蛋白，使貼壁生長的細(xì)胞從培養(yǎng)容器表面分離，便于細(xì)胞傳代和后續(xù)實驗操作。

2. 細(xì)胞克隆篩選：幫助分離單個細(xì)胞，用于克隆培養(yǎng)。

蛋白質(zhì)研究：

1. 蛋白質(zhì)測序：通過有限水解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生特定的肽段，為蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定提供幫助。

2. 結(jié)構(gòu)與功能研究：對蛋白質(zhì)進(jìn)行特定的切割，有助于研究其結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。

制藥領(lǐng)域：

1. 生物藥物生產(chǎn)：參與某些生物制品如胰島素的生產(chǎn)過程，對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和處理。

2. 疫苗制備：處理病原體以獲取有效抗原成分。

食品工業(yè)：

1. 肉類嫩化：分解肉類中的蛋白質(zhì)，改善肉質(zhì)口感。

2. 臨床診斷：檢測某些疾病狀態(tài)下體內(nèi)蛋白酶的活性變化，輔助疾病診斷。

為什么檢測胰蛋白酶的殘留

藥品質(zhì)量與安全保障

1. 確保生物制藥產(chǎn)品的純凈度：對于生物制品如單抗藥物、基因治療產(chǎn)品等，微量的胰蛋白酶殘留都可能影響藥物的穩(wěn)定性和療效，甚至引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，威脅患者生命安全。

2. 符合嚴(yán)格的監(jiān)管要求：制藥行業(yè)受到嚴(yán)格監(jiān)管，檢測胰蛋白酶殘留是保證產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

細(xì)胞培養(yǎng)與研究的準(zhǔn)確性

1. 維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)：在細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，殘留的胰蛋白酶會破壞細(xì)胞間的連接和細(xì)胞外基質(zhì)，影響細(xì)胞的生長、分化和功能，導(dǎo)致實驗結(jié)果的偏差。

2. 保障細(xì)胞實驗的可重復(fù)性：精確控制胰蛋白酶殘留量有助于獲得穩(wěn)定、可靠的實驗數(shù)據(jù)，促進(jìn)科學(xué)研究的進(jìn)展。

食品安全

1. 某些特殊食品的生產(chǎn)過程可能使用胰蛋白酶，檢測殘留可以防止其對消費者健康造成潛在危害。

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展

1. 優(yōu)化生產(chǎn)工藝：通過監(jiān)測胰蛋白酶殘留情況，能夠發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)流程中的問題，從而改進(jìn)工藝，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。

2. 增強(qiáng)市場競爭力：產(chǎn)品中胰蛋白酶殘留量的有效控制可以提升企業(yè)在市場中的聲譽和競爭力。

胰酶殘留相關(guān)法規(guī)要求

2020年版《中國藥典》生物制品通則“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料質(zhì)量控制”中，將非動物來源蛋白水解酶列為中等風(fēng)險的原材料，將用于細(xì)胞消化或蛋白質(zhì)水解的動物來源的酶列為高風(fēng)險的原材料；生產(chǎn)用原材料在生物制品中的殘留物可能因其直接的毒性反應(yīng)、外源因子污染或有害的免疫應(yīng)答,引發(fā)受者產(chǎn)生不良反應(yīng)或影響產(chǎn)品效力。

《基因治療制品質(zhì)量控制研究考慮要點》（2023年5月6日發(fā)布，點擊下載）中，明確指出“對于風(fēng)險高的原材料除了評估去除能力外，如需要可在最適工藝階段或終產(chǎn)品中進(jìn)行殘留量檢測的控制并建立控制標(biāo)準(zhǔn)，作為工藝相關(guān)雜質(zhì)的一部分進(jìn)行控制，如細(xì)胞因 子、生長因子、蛋白酶（如消耗細(xì)胞的 重組胰蛋白酶 TrypLE 的殘留控制）、核酸酶（如工藝中普遍使用的降解核酸的核酸酶）、轉(zhuǎn)染試劑（如 PEI ）、血清及相關(guān)溶劑等。

常見胰酶殘留檢測方法

目前，常見的胰酶殘留檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和質(zhì)譜法等。

1. ELISA 法：

原理：基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理。試劑盒中包被有抗胰酶的抗體，樣品中的胰酶與抗體結(jié)合，再通過與酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，最后加入顯色劑，根據(jù)顏色深淺定量檢測胰酶殘留量。

優(yōu)點：

靈敏度較高，能夠檢測到低濃度的胰蛋白酶殘留。

操作相對簡便，易于標(biāo)準(zhǔn)化。

可同時處理多個樣品，適合大規(guī)模檢測。

缺點：

可能存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

檢測結(jié)果易受樣品基質(zhì)的干擾。

2. HPLC 法：

原理：

利用物質(zhì)在固定相和流動相之間的分配差異來分離和檢測化合物。將樣品經(jīng)過適當(dāng)處理后注入色譜柱，胰酶依據(jù)其化學(xué)性質(zhì)在色譜柱中實現(xiàn)分離，通過檢測器檢測其含量。

優(yōu)點：

分離效果好，特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確測定胰蛋白酶的含量。

重復(fù)性高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

缺點：

儀器設(shè)備昂貴，維護(hù)成本高。

樣品前處理復(fù)雜，操作技術(shù)要求較高

3. 質(zhì)譜法：

原理：

對胰酶分子進(jìn)行電離，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比進(jìn)行分離和檢測，從而確定胰酶的存在和含量。

優(yōu)點：

具有極高的靈敏度和特異性，能夠檢測極低濃度的胰蛋白酶殘留。

可以同時提供胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)信息，有助于更深入的分析

缺點：

儀器昂貴，運行成本高。

對操作人員的技術(shù)要求極高。

解決方案

如上所示，常見的胰酶殘留檢測方法都有各自的優(yōu)劣，雖然在很大程度上能夠提供可靠和準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，但并不能保證絕對的萬無一失。我們可以采取以下措施，盡可能提高胰酶殘留檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，使其接近“無處遁形”的理想狀態(tài)。

1. 多種方法聯(lián)合使用：結(jié)合不同檢測方法的優(yōu)勢，相互驗證和補(bǔ)充，降低單一方法的局限性。

2. 嚴(yán)格控制實驗條件：包括樣品采集、處理、保存的標(biāo)準(zhǔn)化，實驗人員的專業(yè)培訓(xùn)，儀器設(shè)備的定期校準(zhǔn)和維護(hù)等。

3. 優(yōu)化檢測試劑盒和方法：不斷改進(jìn)和研發(fā)更靈敏、特異、穩(wěn)定的檢測試劑和技術(shù)。

4. 建立嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系：對檢測過程進(jìn)行全面監(jiān)控和評估，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

上海逐典生物自研的新一代Trypelectase重組胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，是針對胰蛋白酶殘留檢測開發(fā)的一款高靈敏度的試劑盒，該產(chǎn)品基于雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，定制單克隆抗胰蛋白酶抗體，特異性強(qiáng)，靈敏度高，線性范圍寬廣，批間一致性重復(fù)性好，非常適合于工藝開發(fā)、過程控制和最終質(zhì)量控制。

產(chǎn)品特性

1.靈敏度高：檢測限＜50pg/mL

2.線性范圍廣：檢測范圍0.05 - 3.2ng/mL

3.特異性強(qiáng)，重復(fù)性好：批內(nèi)CV＜10%，回收率高

4.適用動物源與非動物源重組豬胰蛋白酶

檢測數(shù)據(jù)

ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

檢測結(jié)果表明：檢測范圍為0.05 - 3.2ng/mL，檢測限<50pg/mL，定量限30pg/ml。

ELISA試劑盒重復(fù)性檢測

在高、中、低三個濃度點下，CV%值表現(xiàn)良好，均在10%以下，具有很好的精密度和重復(fù)性。

ELISA試劑盒準(zhǔn)確性檢測

通過高、中、低三個濃度下，均得到高回收率，回收率區(qū)間在80%-120%

 

試劑盒使用常見問題與解決方案

Q: 高背景或陰性對照值偏高

A:

1. 洗板不充分：將洗滌劑注入反應(yīng)孔充分洗滌，徹底拍干孔中液體

2. 酶結(jié)合物過量：檢查酶稀釋度，按說明書標(biāo)識的稀釋度稀釋

3. 底物污染：加底物前檢查底物是否為透明無色，請勿用變藍(lán)的底物，重新用新的底物試驗

4. 陰性對照孔被陽性對照污染：注意洗滌時不要把洗液溢出孔外，不使陰陽對照孔液體連接一起

5. 不同批次試劑混用：檢查試劑批號，請勿用不同批次試劑

Q: 顯色信號弱

A:

1. 試劑過期：檢查試劑盒有效期，請勿用過期試劑

2. 孵育時間過短：按說明書中規(guī)定的時間孵育

3. 試劑污染：檢查試劑是否污染，請勿用污染的試劑

4. 酶標(biāo)儀濾光片不匹配：檢查酶標(biāo)儀設(shè)置及濾光片是否匹配

5. 試劑盒平衡不充分：確保試劑盒試驗前平衡至室溫

6. 顯色時間不夠：增加底物顯色時間

Q: 無顯色信號

A:

1. 檢測抗體、酶、或顯色劑漏加：檢查試驗操作流程，重復(fù)試驗

2. 酶被稥氮鈉污染：請使用重新配制的試劑

3. 試劑添加順序有誤：檢查復(fù)核試驗添加順順序、流程、重復(fù)試驗

Q: 標(biāo)曲佳但是樣品孔無信號

A:

1. 樣品中靶標(biāo)物含量低或樣品中無靶標(biāo)物：設(shè)置陽性對照、重復(fù)實驗

2. 樣品基質(zhì)效應(yīng)影響檢測：重新稀釋樣品后復(fù)測

Q: 標(biāo)曲佳但是樣品信號偏高

A: 樣品中待檢物含量超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：重新稀釋樣品后復(fù)測

Q: 邊緣效應(yīng)

A: 孵育溫度不均衡：孵育時每步均使用新的封版膠紙，避免在環(huán)境溫度變化大的地方孵育，勿香放反應(yīng)板

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