靶向T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域-3的124I/125I標(biāo)記

文獻(xiàn)信息
北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫(yī)學(xué)科，國(guó)家藥監(jiān)局放射性藥物研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院等團(tuán)隊(duì)合作的研究成果Construction and Preclinical Evaluation of ¹²⁴I/¹²⁵I‑Labeled Antibody Targeting T Cell Immunoglobulin and Mucin Domain‑3（靶向T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域-3的¹²⁴I/¹²⁵I標(biāo)記抗體的構(gòu)建及臨床前評(píng)估）在學(xué)術(shù)期刊《Molecular Pharmaceutics》發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物PET/CT（型號(hào)：Super Nova）產(chǎn)品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

 該研究的通訊作者為北腫楊志主任，朱華研究員以及趙傳科副教授。第一作者為淘金萍同學(xué)，曾子晴醫(yī)師以及何成雪同學(xué)。

文獻(xiàn)背景
摘要:T細(xì)胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3 (TIM3;HAVCR2)是一種跨膜蛋白，對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)施加負(fù)調(diào)節(jié)控制。研究表明，TIM3在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)中的表達(dá)上調(diào)。本研究利用雜交瘤技術(shù)制備了一系列靶向TIM3的單克隆抗體。其中，C23表現(xiàn)出良好的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合，作者通過(guò)n -溴琥珀酰亞胺(NBS)介導(dǎo)的單克隆抗體C23標(biāo)記開(kāi)發(fā)了¹²⁴I/¹²⁵I-C23放射性示蹤劑。使用過(guò)表達(dá)TIM3的293T-TIM3細(xì)胞系和親本293T細(xì)胞評(píng)估結(jié)合親和力和特異性。在HEK293TIM3異種移植模型和4T1-(小鼠乳腺癌細(xì)胞)和CT26(小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞)異體移植模型中檢測(cè)¹²⁴I/¹²⁵I-C23的生物分布和體內(nèi)成像。分別在3.7~7.4 MBq ¹²⁴I-C23靜脈給藥后4、24、48、72和/或96小時(shí)對(duì)模型小鼠進(jìn)行微PET/CT成像。此外，對(duì)解剖腫瘤器官中TIM3的表達(dá)進(jìn)行免疫組化(IHC)染色，并評(píng)估腫瘤中相應(yīng)的程序性死亡1 (PD1)、CD3和CD8的表達(dá)。C23單克隆抗體(mAb)特異性結(jié)合TIM3蛋白，解離常數(shù)為23.28 nM。成功制備了¹²⁴I-C23和¹²⁵I-C23示蹤劑，標(biāo)記率分別為83.59±0.35%和92.35±0.20%，放射化學(xué)純度超過(guò)95.00%。穩(wěn)定性結(jié)果表明，¹²⁴I/¹²⁵I-C23在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和5%人血清白蛋白(HSA)中的放射化學(xué)純度在96 h后仍>80%，293T-TIM3細(xì)胞對(duì)¹²⁵I-C23的攝取為2.80±0.12%，顯著高于293T細(xì)胞(1.08±0.08%)，阻斷組在60和120 min時(shí)均顯著阻斷293T-TIM3細(xì)胞對(duì)¹²⁵I-C23的攝取。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)分析顯示，¹²⁵I-C23的消除時(shí)間為14.62h，分布時(shí)間為0.4672h。顯微PET/CT成像顯示，293T-TIM3模型¹²⁴I-C23探針攝取與陰性對(duì)照組和阻斷組的探針攝取有顯著差異。在人源化小鼠模型中，¹²⁴I-C23探針在4T1和CT26模型中有明顯的特異性攝取，24h時(shí)在腫瘤組織中有最大的攝取(4T1和CT26人源化TIM3小鼠腫瘤模型的SUVmax(最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值)分別為0.59±0.01和0.76±0.02)。來(lái)自這些小鼠模型的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)顯示相似的TIM3表達(dá)。TIM3表達(dá)的腫瘤組織中也有CD3、CD8細(xì)胞和PD-1的表達(dá)。TIM3靶向抗體C23具有良好的親和力和特異性。¹²⁴I/¹²⁵I-C23探針在體外和體內(nèi)對(duì)TIM3具有明顯的靶向特異性。作者的結(jié)果表明¹²⁴I/¹²⁵I-C23是一種很有前途的TIM3成像示蹤劑，在監(jiān)測(cè)免疫檢查點(diǎn)藥物療效方面可能具有很大的潛力。

實(shí)驗(yàn)方法
動(dòng)物異種移植物模型和顯微PET/CT成像
所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究使用健康雌性NOD SCID、BALB/c-nu和KM小鼠均為4~6周齡，TIM3人源化BALB/c小鼠。采用NOD SCID小鼠接種3×10⁶個(gè)293T/293T-TIM3細(xì)胞構(gòu)建293T/293T-TIM3異種移植模型，BALB/c-nu小鼠接種3×10⁶個(gè)A549-TIM3細(xì)胞構(gòu)建A549-TIM3異種移植模型，BALB/c小鼠(hTIM3)右腋窩接種4T1或CT26細(xì)胞建立異種移植模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約0.5−1cm³時(shí)，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在0.5%碘化鉀 (KI)溶液阻斷甲狀腺后，異種移植模型和同種異體移植模型通過(guò)尾靜脈注射124I-C23 (3.7-7.4 MBq)。然后在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行靜態(tài)PET掃描15分鐘。重建顯微PET數(shù)據(jù)。最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)是通過(guò)描述每個(gè)器官的感興趣區(qū)域(ROI)來(lái)估計(jì)的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
將¹²⁴I標(biāo)記的C23單克隆抗體注射到293T和293T-TIM3荷瘤小鼠體內(nèi)，進(jìn)行微PET/CT成像。在阻斷組中，除¹²⁴I-C23外，向攜帶293T-TIM3的小鼠注射過(guò)量的C23抗體。通過(guò)正電子發(fā)射斷層掃描(PET)圖像描繪293T和293T-TIM3模型小鼠各器官的ROI，并獲得SUVmax。¹²⁴I-C23被肝臟代謝，更多分布于血管化程度較高的器官，如肝臟和肺(圖4B−4D)，這與生物分布研究的結(jié)果一致。與陰性對(duì)照組和阻斷組相比，實(shí)驗(yàn)組293T-TIM3腫瘤組織對(duì)探針有明顯的攝取(圖4A)。此外，注射后24h, 293T-TIM3模型腫瘤的SUVmax與阻斷組的SUVmax相比有顯著差異(0.46±0.0047 vs 0.40±0.0163 vs 0.36±0.0082,P < 0.01)(圖4B−4D)。

圖4.腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射¹²⁴I-C23探針后4、24、48、96 h對(duì)293T/293T-TIM3異種移植模型進(jìn)行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。(B)注射¹²⁴I-C23后不同時(shí)間點(diǎn)293T-TIM3模型小鼠各器官的SUVmax;(C)注射¹²⁴I-C23后不同時(shí)間點(diǎn)293T模型小鼠各臟器的SUVmax;(D) ¹²⁴I-C23和100mg/kgC23阻斷后293T-TIM3模型小鼠各器官不同時(shí)間點(diǎn)的SUVmax。
 

將¹²⁴I-C23注射到A549-TIM3模型進(jìn)行顯微PET/CT成像(圖5A)，注射后2h測(cè)得最高攝量 (SUVmax=0.89±0.0163);此外，A549-TIM3模型的代謝與293T-TIM3模型的代謝一致(圖4A)。此外，A549和A549-TIM3腫瘤區(qū)域的¹⁸F-FDG顯微PET/CT成像顯示SUVmax無(wú)顯著差異(圖5B)。

圖5. 腫瘤模型的顯微PET/CT成像。(A)注射124I-C23探針后2、24、48、72、96 h對(duì)A549-TIM3異種移植模型進(jìn)行微PET /CT成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位;(B)注射¹⁸F-FDG探針60min后，用Micro-PET/CT對(duì)A549/A549-TIM3異種移植模型進(jìn)行成像，白色箭頭顯示腫瘤已定位。

文獻(xiàn)結(jié)論
在這項(xiàng)研究中，TIM3被證明是預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的可行靶點(diǎn)，而¹²⁵I-C23的體內(nèi)生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)研究可能有助于更好地了解免疫治療反應(yīng)。¹²⁴I-C23的Micro PET/CT成像顯示出良好的腫瘤背景攝取和靶向特異性，這為進(jìn)一步研究¹²⁴I/¹²⁵I-C23和其他TIM3預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物提供了支持。在未來(lái)，免疫治療生物標(biāo)志物成像可用于治療監(jiān)測(cè)和患者分層。

使用設(shè)備

   
Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）