D-Lin-MC3-DMA遞送siRNA載體

D-Lin-MC3-DMA 是一種可電離的陽離子脂質(zhì), 是一種有效的遞送 siRNA 載體。

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D-Lin-MC3-DMA遞送siRNA載體的生物活性

體外研究

MC3脂質(zhì)納米顆粒的制備

在這里我們提供了FDA批準(zhǔn)的Patisiran（一種針對(duì)轉(zhuǎn)甲狀腺素(TTR) mRNA的siRNA）的LNP中脂質(zhì)的摩爾比例。該配方中脂質(zhì)的摩爾比為D-Lin-MC3-DMA:DSPC:膽固醇:PEG2000-C-DMG=50:10:38.5:1.5，RNA與脂質(zhì)的重量比為0.05（wt/wt）。

A. 脂質(zhì)混合物的制備

1、在乙醇中溶解脂質(zhì)并制備10 mg/mL的儲(chǔ)備液。脂質(zhì)儲(chǔ)備液可以在-20°C下儲(chǔ)存以備后用。

注1：帶電性脂質(zhì)通常是液體。由于黏度高，應(yīng)該使用稱重而不是依賴自動(dòng)移液器的體積。

注2：溶液中的膽固醇應(yīng)保持溫暖（>37℃）以維持流動(dòng)性。及時(shí)轉(zhuǎn)移膽固醇溶液以避免降溫。

2、根據(jù)以下描述制備脂質(zhì)混合物溶液。每毫升脂質(zhì)混合物添加以下內(nèi)容：548 µL 10mg/mL D-Lin-MC3-DMA（HY-112251），254 µL 10mg/mL 膽固醇（HY-N0322），134 µL 10mg/mL DSPC（HY-W040193），以及64 µL PEG2000-C-DMG（HY-145411）。充分混合溶液以得到清澈的溶液。該混合物含有總計(jì)10 mg的脂質(zhì)。

注3：脂質(zhì)選擇和比例可以根據(jù)需要進(jìn)行更改，這會(huì)影響LNP的性質(zhì)（大小、多分散性和功效）以及所需的mRNA量。

B. siRNA的制備

1、使用100 mM pH 5的乙酸鈉緩沖液制備166.7 µg/mL的siRNA溶液。

注4：脂質(zhì):siRNA重量比會(huì)影響封裝效率�？梢詼�(zhǔn)備其他重量比的替代配方，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。

C. 混合

有三種常用的方法可實(shí)現(xiàn)溶液的快速混合：移液器混合法、渦旋混合法和微流控混合法。所有這些混合方法都可用于各種應(yīng)用。

需要注意的是，移液器混合法和渦旋混合法可能產(chǎn)生較不均勻的LNP，封裝效率較低且容易出現(xiàn)變化。微流控裝置能夠以高度可控和可重復(fù)的方式快速混合，得到均勻的LNP和高封裝效率。在這些裝置中，乙醇脂質(zhì)混合物和水溶液被迅速組合在單獨(dú)的流體中，并在兩個(gè)流體交匯時(shí)形成LNP，然后收集到單個(gè)收集管中。

1、移液器混合法：

1.1. 移取3 mL的siRNA溶液，并迅速加入1 mL的脂質(zhì)混合物溶液（通常使用1:3的乙醇脂質(zhì)混合物與水緩沖液的比例）�？焖偕舷乱埔�20-30秒。

1.2. 將混合后的溶液在室溫下孵育至多15分鐘。

1.3. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小時(shí)，使用0.2 μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾，并儲(chǔ)存在4°C。

2、渦旋混合法：

1.1. 在渦旋混合器上以適度的速度渦旋3 mL的siRNA溶液。然后，快速加入1 mL的脂質(zhì)混合物溶液到渦旋的溶液中（通常使用乙醇型脂質(zhì)混合物與水緩沖液的1:3比例）。繼續(xù)渦旋混合產(chǎn)生的分散液20-30秒。

1.2. 將混合后的溶液在室溫下孵育至多15分鐘。

1.3. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小時(shí)，使用0.2 μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾，并儲(chǔ)存在4°C。

3、微流控混合法：

1.1 在微流控設(shè)備中，將3 mL的siRNA緩沖溶液和1 mL的脂質(zhì)混合物溶液以總流速12 mL/min的速率混合（通常使用乙醇型脂質(zhì)混合物與水緩沖液的1:3比例）。

注 5：流速比和總流速等參數(shù)可以進(jìn)行調(diào)整以微調(diào)LNPs。

1.2. 混合后，LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小時(shí)，使用0.2 μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾，并儲(chǔ)存在4°C。

體內(nèi)研究

含有二硬脂酰磷脂酰膽堿 (DSPC) 的脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 和可電離的氨基脂質(zhì)，例如二亞油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯 (DLin-MC3-DMA) 是有效的體內(nèi) siRNA 運(yùn)載工具。LNP-siRNA 系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化以在小鼠靜脈注射后的肝細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)最大基因沉默效力，其中包含摩爾比為 50/10/38.5/1.5 的 DLin-MC3-DMA (MC3)、DSPC、膽固醇和聚乙二醇 (PEG)-脂質(zhì)。DLin-MC3-DMA 具有優(yōu)化的 pKa 值，可顯著增強(qiáng)效力。