實驗操作小技巧 ：分離線粒體或透化的組織和細胞詳解

01.透化組織或細胞與分離的線粒體（pti、pce與imt）

1.1. 一般注意事項

1. 呼吸量通常與分離線粒體（imt）中的線粒體蛋白量或透化組織（pti；包括滲透肌纖維pfe）中的組織量有關，而在活細胞和滲透細胞中，每個細胞的O2流量通常是歸一化的。需要注意，對每個線粒體蛋白的呼吸通量變化的解釋是不同的，每質量的組織是組織特異性，而不是線粒體特異性通量，每百萬細胞呼吸通量隨細胞大小變化，因此不能比較如血小板和成纖維細胞或心肌細胞。

2. 使用人體骨骼肌滲透性纖維（pfe）對進行的呼吸檢測結果與imt的數(shù)據(jù)一致。

3. 將電子傳遞到呼吸系統(tǒng)的不同復合物、三羧酸循環(huán)的不同片段和轉運體的特定底物，用于特定線粒體通路的功能評估。

4. 評估氧化磷酸化的最大能力需要底物組合，以重建生理三羧酸循環(huán)功能。

5. 很少有關于pfe的研究報道氧通量對不同底物濃度的依賴性，且pfe或pce和imt的直接比較也很少。

6. 因為敏感性不同，pce和pti的最佳解偶聯(lián)劑濃度不能從imt的研究中推斷出來。

1.2. 透化組織或細胞的優(yōu)勢 (pti、pce)

1. 與imt相比，pti需要更少的組織或更少的細胞。使用O2k，每次實驗測試僅需1 mg 濕重的心臟纖維，或30萬個細胞（成纖維細胞、內皮細胞），在37°C的2 ml艙室中。

2. 與優(yōu)化pti相比，imt的優(yōu)化可能會花費更多時間。

3. 所有類型的線粒體都可以在pti和pce中通過實驗獲得，即imt制備允許分離不同的線粒體。

1.3.分離線粒體 (imt) 的優(yōu)勢

1. imt的制備需要分離和研究不同的線粒體亞群。

2. imt的混懸液代表組織樣本的平均值。

3.由于O2擴散到非灌注纖維束中的線粒體，滲透肌纖維呼吸的氧依賴性增加了兩個數(shù)量級。因此，我們選擇imt來進行線粒體氧動力學的研究（小的懸浮細胞也是一個很好的模型）。在對肌肉纖維的研究中，必須嚴格避免低氧水平。電解產(chǎn)生的O2和H2O2滴定到含有H2O2的MiR06中，增加了O2k艙室內的O2濃度。

4. ADP必須在高濃度下加入到pfi中，以達到最大的氧化磷酸化容量，因為擴散限制和線粒體外膜可能發(fā)揮不同于imt的屏障功能。

 

02.透化組織制備和呼吸測量

 

1. 機械組織分離的評價：機械組織分離必須使用適當鋒利的鑷子，其分離程度可以通過觀察分離的纖維束的顏色的變化來評價（類似于肝組織），將培養(yǎng)皿放在深色背景上時，可更好的觀察到這一點。常規(guī)實驗的一個實際限制可能是10-20 mg濕重的組織，隨后被分成2-5 mg的樣本進行實驗。

2. 細胞膜的機械和化學透性：機械組織制備導致細胞膜的部分（骨骼�。┗蛲耆�（心肌、肝組織）透化。這種方法可能無法獲得完整的活細胞。部分透化的樣品需額外的化學透化（皂苷或洋地黃苷），通過標準化的孵育條件使線粒體外膜和內膜保持完好無損。在僅僅是機械滲透的組織中，必須通過在氧化磷酸化狀態(tài)下的呼吸中添加皂苷或洋地黃苷來檢查樣品是否完全透化。在這些條件下，完全透化的細胞預計不會有呼吸刺激。

3. 在每次實驗中測量1-2 mg組織的耗氧量需要高分辨率的呼吸測量。儀器對O2k的檢測極限為1pmolO2∙-1∙mL-1，直到空氣飽和。

4. 按照標準程序，實驗前組織樣品的穩(wěn)定性通常是足夠的。通過將組織樣品保存在細胞保存培養(yǎng)基中可延長其穩(wěn)定性。因為一些細胞在組織取樣期間被透化，可將透化后的樣品儲存時間最小化，或透化后保存在細胞保存培養(yǎng)基中以延長儲存時間。

呼吸檢測中樣品制備的穩(wěn)定性取決于高質量線粒體呼吸介質的應用。高穩(wěn)定性允許應用復雜的和擴展的底物-解偶聯(lián)抑制劑滴定（SUIT）方案。