細胞冷凍保存與復(fù)蘇原理

方法將生物材料降至超低溫，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽�凍存的生物材料恢�?fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C 的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。

水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時，大量水分會因此進入細胞內(nèi)，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進一步下降，細胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。

冷凍速率

冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當(dāng)細胞被冷至-

50C 時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5～-150C 之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細胞內(nèi)水分子為了和細胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內(nèi)水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非�？欤�即超快速冷凍），則細胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。 不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。

當(dāng)冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。

超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時間暴露而受損。

不同細胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的最適冷凍速率分別為 1.60C/min、70C/min 和 2000C/min。細胞與細胞之間的最適冷凍速率可在 1.60C～3000C/min，故對一種細胞

進行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。

冷凍保存溫度

冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)

過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。
 

不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不

同。但從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是 目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C 時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應(yīng)用-700C～-800C 保存細胞，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰點到-400C 范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。

復(fù)蘇速率

冷凍保護體外培養(yǎng)物，除了必須有最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復(fù)蘇時也必

須有最佳的復(fù)溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。復(fù)溫速率是指在細胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細胞存活率。一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在 370C 水浴中，于 1-2 分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復(fù)溫時造成的細胞損傷非�？�，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。

冷凍保護劑

冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，

只有紅細胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以 0.3～6000C/min 的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。

冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝

固之前，滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時，細胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和 DMSO 并不防止細胞內(nèi)結(jié)冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預(yù)冷，讓甘油或 DMSO 等成分滲透到細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)外達到平衡以起到充分的保護作用。目前 DMSO 的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO 在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在 40C 時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細胞內(nèi)。所以，凍存時 DMSO 平衡多在 40C 下進行，一般需要 40～60 分鐘。

非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。

不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由

于許多冷凍保護劑（如 DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復(fù)溫后應(yīng)及時洗滌冷凍保護劑。

冷凍保存方法

按照冷凍保護液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃

化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C～-800C，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C 以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細胞凍存最常用的仍是前一種方法。

非玻璃化凍存方法

下面以腫瘤細胞和雜交瘤細胞為例，介紹非玻璃化凍存細胞的詳細過程。

（1）儀器設(shè)備：普通冰箱、-300C 低溫冰箱和-700C～-800C 超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等；

（2）凍存管：容量為 1ml 或 1.5ml；

（3）冷凍保護液：一般是以 9 份小牛血清或細胞培養(yǎng)液與 1 份 DMSO 混合而成�，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；

（4）待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。

操作過程

1. 待凍存細胞懸液的制備

(1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)；

(2) 將細胞懸液以 800～1000r/min 離心 5min，去上清夜；

(3) 向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達 1×106～1×107 個/ml；

(4) 按每管 1～1.5ml 的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；

(5) 再凍存管上做好標(biāo)記，包括細胞代號及凍存日期。

2. 分級冷凍

(1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約 40min；

(2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C～-200C），約 30～60min；

(3) 將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C），放置 30min 左右；

(4) 然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C～-800C），過夜；

(5) 最后將凍存管投入液氮保存。

3. 記錄

做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以

及操作人員。

凍存結(jié)果

如此凍存的細胞，其存活率可達 90%以上。

討論

在使用 DMSO 前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO 對人體有毒，故在配制時最好帶手套。在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。

應(yīng)注意控制凍存細胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細

胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇 1～2 管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。
 

凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復(fù)蘇時，需要從-1960C 的液氮中取出凍存管，

立即投入 37～400C 溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。

玻璃化凍存方法

以下以人單核細胞為例說明這種細胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）。
主要材料

（1）冷凍保護液：為 Hanks 平衡鹽溶液加入 20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和 10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用 2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）凍存管：SILASTIC 玻璃小管，內(nèi)徑 3mm，外徑 4.5mm；

（3）設(shè)備：液氮儲存罐；

（4）待凍存細胞：人類外周血單核細胞。

凍存過程

（1） 用常規(guī)方法分離全血中單核細胞；

（2） 在冰浴中預(yù)冷冷凍保護液；

（3） 將裝有單核細胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)（冰�。�；

（4） 沿離心管壁緩慢滴加預(yù)冷的冷凍保護液。滴加過程為：前 3min 以 0.3ml/min 速度滴加，后 5min 以0.6ml/min 速度滴加，余下的凍存液以 0.75ml/min 速度滴加。2×107 個細胞要滴加 15ml 凍存液。滴加的時間在 15min 左右。最終細胞密度要在 1×106～1.5×106 個細胞/ml，邊滴加邊輕輕晃動離心管；

（5） 輕輕吹吸混勻細胞冷凍懸液；

（6） 將細胞冷凍懸液分裝于凍存管中。12cm 長的凍存管裝 0.8ml 細胞冷凍懸液；

（7） 將凍存管兩端以火焰封口；

（8） 最后將凍存管直接投入液氮中保存。降溫速度約為 6000C/min。

凍存結(jié)果

如此凍存的細胞，其存活率可達 90%以上。

討論

玻璃化凍存法對細胞活性的保存具有較好的效果，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使

用。目前，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細胞的凍存。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān)。

因為玻璃化冷凍保護液中的冷凍保護劑的濃度較高，室溫下對細胞具有毒性（但在 40C 時毒性大為減

弱）。所以，冷凍保護液的滴加全過程必須在 40C 冰浴中進行。另外，滴加速度要緩慢，如果滴加速度過快，則在細胞外產(chǎn)生很高的滲透壓，造成細胞膜的損傷，導(dǎo)致細胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護劑有足夠的時間緩慢滲透到細胞內(nèi)，達到細胞內(nèi)外的平衡。

 

主要材料

（1） 儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機；

（2） 培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。

復(fù)蘇過程

（1） 調(diào)配 370C～400C 的溫水，或?qū)⒑銣厮�浴箱的溫度調(diào)節(jié)至 370C～400C；

（2） 從液氮中取出凍存管，立即投入 370C～400C 溫水中迅速晃動，直至凍存液完全溶解；

（3） 將細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約 5ml 培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；

（4） 將細胞懸液經(jīng) 800～1000r/min 離心 5min，棄上清夜；

（5） 向細胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi)，補足培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

結(jié)果

復(fù)蘇后的細胞應(yīng)該保持其凍存時的活力，活細胞數(shù)達 90%以上。

討論

細胞凍存懸液一旦融解后，要盡快離心除去冷凍保護液，防止冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。實驗人員

在復(fù)蘇細胞過程中，同樣應(yīng)具有自我保護意識，避免被液氮凍傷。

玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
以下以人的單核細胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。

（1）設(shè)備：高速離心機；

（2）培養(yǎng)用液：添加 20%胎牛血清的 Hanks 平衡鹽溶液、培養(yǎng)液。

操作過程

(1) 將凍存管從液氮中取出，立即投入冰浴中 5min。復(fù)溫速率約 5600C/min。一次可以進行多個凍存管的復(fù)蘇；

(2) 將凍存管兩端剪斷，可以將 5ml 細胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中；

(3) 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含 20%胎牛血清的 Hanks 平衡鹽溶液。前 10min 以 0.2ml/min的速度加入，后 10min 以 0.5ml/min 的速度加入，接著的 15min 以 0.75ml/min 的速度加入，最后 30min 以1ml/min 的速度加入。全過程約為 65min，都在冰浴中進行；

(4) 將稀釋后的細胞懸液以 400r/min 離心 5min，去除上清。向細胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細胞，用于培養(yǎng)。

結(jié)果

復(fù)蘇后的細胞應(yīng)該保存其凍存時的活力，活細胞數(shù)達 90%以上。

討論

復(fù)蘇時，冷凍保護液的稀釋及去除過程與凍存前冷凍保護液的滴加過程一樣，不能在室溫下而必須在

40C 冰浴中進行，避免在室溫下冷凍保護劑對細胞產(chǎn)生毒性。稀釋過程也要緩慢進行，保證有足夠的時間讓冷凍保護劑從細胞內(nèi)滲出，以達到細胞內(nèi)外的平衡，避免高滲透壓的損傷。