載體構建技術介紹
1. 什么是載體構建技術？
載體構建（Vectorcon Struction）是進行分子生物學研究的常用手段之一，使用該技術將外源DNA片段插入至人工構建的質粒中，目的是把連接好的DNA分子運送到受體細胞當中進行復制擴增用于后續(xù)的科研試驗。
2. 常用的載體構建方法？
目前常用的載體構建技術包括重疊延伸PCR法、傳統(tǒng)的酶切連接法以及同源重組法等。傳統(tǒng)的酶切連接法是用相同的限制性內切酶對質粒和含有目的片段DNA進行消化，得到具有相同的粘性末端或平末端的線性DNA，純化酶切產物，再利用DNA連接酶片段與載體相連，得到重組質粒。將重組質粒轉入感受態(tài)細胞中，進行后續(xù)的篩選、擴增。同源重組克隆技術通過同源重組酶將兩個具有相同末端序列的線性化載體和插入片段重組成重組質粒，同樣轉入感受態(tài)細胞中進行篩選、擴增。
3. 常用的載體構建表達系統(tǒng)？
原核系統(tǒng)表達載體：大腸桿菌表達系統(tǒng)要求載體包含SD序列、一個強的啟動子及其兩側的調控序列、啟動子與外源基因之間有正確的閱讀框架以及外源基因下游的轉錄終止區(qū)。最常用的載體是pET系列和pGEX系列。卡梅德生物通過密碼子優(yōu)化、改造表達載體元件以及融合標簽與宿主的多樣性選擇等實現(xiàn)重組蛋白的高效率表達。
哺乳動物細胞表達載體：包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件，載體選擇主要為pcDNA3.1系列和pcDNA4系列。卡梅德生物設計的高表達載體能為客戶提供高表達水平的重組蛋白哺乳動物細胞表達與制備服務。
酵母質粒載體：由選擇標記（例如營養(yǎng)缺陷型篩選標記HIS3、抗生素篩選標記氯霉素等）和調控序列（包括啟動子、ARS、2μM質粒、酵母著絲粒區(qū)段等），載體選擇主要為pPIC9系列和pPIC3.5系列�？返律锬軌蛲瑫r為客戶提供多種規(guī)格的蛋白酵母發(fā)酵規(guī)格、配合蛋白純化平臺，在短時間內獲得高質量的重組蛋白。
昆蟲表達載體：桿狀病毒表達載體是以Sf9和Sf21細胞系以及家蠶為表達宿主，將外源基因克隆于轉移載體上，與病毒DNA共轉染細胞后，經同源重組和篩選而得到重組病毒。載體選擇主要為pFastBac1系列和pFastBacHT系列�？返律锔鶕f9，Sf21，Hi-5及S2昆蟲細胞的密碼子偏愛性，免費為您進行密碼子優(yōu)化，從而有效提高重組蛋白表達量。
4. 載體構建的基本流程？
4.1酶切連接法
（1）載體選擇：
根據構建重組質粒的目的不同選擇合適的載體，并對目的片段與載體含有的酶切位點進行分析。
（2）引物設計：
能與目的片段特異性結合并進行擴增，引物長度約18-25bp，GC含量在40%-60%之間，需要加入兩個合適的酶切位點。
（3）PCR擴增：
以研究對象的DNA/cDNA為模版，經PCR擴增目的片段后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收目的基因條帶。
（4）載體和目標片段的限制性酶切：
使用相應的限制性內切酶，對目的片段和質粒載體進行雙酶切實驗。加樣全程于冰上操作，用移液槍吹勻樣品，輕彈管底去除氣泡后再用掌心離心機將樣品甩至管底，最終于37℃水浴鍋內酶切1.5 h。反應結束后對產物進行1%瓊脂糖電泳，若條帶位置正確則對其進行產物回收。
（5）連接轉化：
使用T4 DNA Ligase對酶切后的回收產物進行酶連。該酶在16℃條件下對粘性末端連接效率很高，酶連過夜即可充分連接。
（6）挑取單克隆提取質粒驗證：
菌液PCR：將單克隆菌落挑至含有相應抗性的1.5 mL EP管中培養(yǎng)4~5 h，按照擴增目的片段所用的PCR體系加入各組分，其中將模板DNA為菌液（體積1 µL），同時設置水為模板的陰性對照組以及擴增的目的片段作為陽性對照組。反應完畢后將所有樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶亮度以及位置初步判斷是否酶連成功。
酶切驗證：以目的片段的雙酶切組作為陽性對照，以空載的雙酶切組作為陰性對照，將反應后樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳。若樣品組有與陽性對照組和陰性對照組位置一致的兩條帶，則進一步證明該重組質粒連接成功。
測序驗證：送至測序公司，比對結果進行驗證。
4.2同源重組法
（1）載體線性化：使用限制性內切酶消化法或反向PCR擴增法，選擇合適的克隆位點對載體進行線性化。
（2）插入片段的獲得：在插入片段正反向擴增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，使擴增后的插入片段5'和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應一致的同源序列（15-20 bp，不包括酶切位點）。
（3）重組反應：回收瓊脂糖凝膠電泳產物，根據測得的濃度計算重組反應所需的線性化載體和插入片段所需DNA量。
（4）轉化感受態(tài)
（5）重組反應產物鑒定：菌液PCR、測序。
圖1 表達質粒示意圖
5. 同源重組法與傳統(tǒng)酶切法的對比？
同源重組法對酶切位點的依賴性較低，構建耗時較短，構建過程簡單可以省去很多精力，但假陽性率略高。
傳統(tǒng)酶切法應用的時間長、技術成熟，但依賴于酶切位點的選擇，酶切效率與連接效率低且構建過程比較繁瑣。
6. 載體構建技術的應用？
（1）構建克隆載體用于擴增目的基因；（2）構建表達載體用于表達目的基因；（3）構建基因編輯載體用于編輯基因；（4）構建病毒包裝載體用于轉染細胞。
載體構建（Vectorcon Struction）是進行分子生物學研究的常用手段之一，使用該技術將外源DNA片段插入至人工構建的質粒中，目的是把連接好的DNA分子運送到受體細胞當中進行復制擴增用于后續(xù)的科研試驗。
2. 常用的載體構建方法？
目前常用的載體構建技術包括重疊延伸PCR法、傳統(tǒng)的酶切連接法以及同源重組法等。傳統(tǒng)的酶切連接法是用相同的限制性內切酶對質粒和含有目的片段DNA進行消化，得到具有相同的粘性末端或平末端的線性DNA，純化酶切產物，再利用DNA連接酶片段與載體相連，得到重組質粒。將重組質粒轉入感受態(tài)細胞中，進行后續(xù)的篩選、擴增。同源重組克隆技術通過同源重組酶將兩個具有相同末端序列的線性化載體和插入片段重組成重組質粒，同樣轉入感受態(tài)細胞中進行篩選、擴增。
3. 常用的載體構建表達系統(tǒng)？
原核系統(tǒng)表達載體：大腸桿菌表達系統(tǒng)要求載體包含SD序列、一個強的啟動子及其兩側的調控序列、啟動子與外源基因之間有正確的閱讀框架以及外源基因下游的轉錄終止區(qū)。最常用的載體是pET系列和pGEX系列。卡梅德生物通過密碼子優(yōu)化、改造表達載體元件以及融合標簽與宿主的多樣性選擇等實現(xiàn)重組蛋白的高效率表達。
哺乳動物細胞表達載體：包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件，載體選擇主要為pcDNA3.1系列和pcDNA4系列。卡梅德生物設計的高表達載體能為客戶提供高表達水平的重組蛋白哺乳動物細胞表達與制備服務。
酵母質粒載體：由選擇標記（例如營養(yǎng)缺陷型篩選標記HIS3、抗生素篩選標記氯霉素等）和調控序列（包括啟動子、ARS、2μM質粒、酵母著絲粒區(qū)段等），載體選擇主要為pPIC9系列和pPIC3.5系列�？返律锬軌蛲瑫r為客戶提供多種規(guī)格的蛋白酵母發(fā)酵規(guī)格、配合蛋白純化平臺，在短時間內獲得高質量的重組蛋白。
昆蟲表達載體：桿狀病毒表達載體是以Sf9和Sf21細胞系以及家蠶為表達宿主，將外源基因克隆于轉移載體上，與病毒DNA共轉染細胞后，經同源重組和篩選而得到重組病毒。載體選擇主要為pFastBac1系列和pFastBacHT系列�？返律锔鶕f9，Sf21，Hi-5及S2昆蟲細胞的密碼子偏愛性，免費為您進行密碼子優(yōu)化，從而有效提高重組蛋白表達量。
4. 載體構建的基本流程？
4.1酶切連接法
（1）載體選擇：
根據構建重組質粒的目的不同選擇合適的載體，并對目的片段與載體含有的酶切位點進行分析。
（2）引物設計：
能與目的片段特異性結合并進行擴增，引物長度約18-25bp，GC含量在40%-60%之間，需要加入兩個合適的酶切位點。
（3）PCR擴增：
以研究對象的DNA/cDNA為模版，經PCR擴增目的片段后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收目的基因條帶。
（4）載體和目標片段的限制性酶切：
使用相應的限制性內切酶，對目的片段和質粒載體進行雙酶切實驗。加樣全程于冰上操作，用移液槍吹勻樣品，輕彈管底去除氣泡后再用掌心離心機將樣品甩至管底，最終于37℃水浴鍋內酶切1.5 h。反應結束后對產物進行1%瓊脂糖電泳，若條帶位置正確則對其進行產物回收。
（5）連接轉化：
使用T4 DNA Ligase對酶切后的回收產物進行酶連。該酶在16℃條件下對粘性末端連接效率很高，酶連過夜即可充分連接。
（6）挑取單克隆提取質粒驗證：
菌液PCR：將單克隆菌落挑至含有相應抗性的1.5 mL EP管中培養(yǎng)4~5 h，按照擴增目的片段所用的PCR體系加入各組分，其中將模板DNA為菌液（體積1 µL），同時設置水為模板的陰性對照組以及擴增的目的片段作為陽性對照組。反應完畢后將所有樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶亮度以及位置初步判斷是否酶連成功。
酶切驗證：以目的片段的雙酶切組作為陽性對照，以空載的雙酶切組作為陰性對照，將反應后樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳。若樣品組有與陽性對照組和陰性對照組位置一致的兩條帶，則進一步證明該重組質粒連接成功。
測序驗證：送至測序公司，比對結果進行驗證。
4.2同源重組法
（1）載體線性化：使用限制性內切酶消化法或反向PCR擴增法，選擇合適的克隆位點對載體進行線性化。
（2）插入片段的獲得：在插入片段正反向擴增引物的5’端引入線性化載體兩末端同源序列，使擴增后的插入片段5'和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應一致的同源序列（15-20 bp，不包括酶切位點）。
（3）重組反應：回收瓊脂糖凝膠電泳產物，根據測得的濃度計算重組反應所需的線性化載體和插入片段所需DNA量。
（4）轉化感受態(tài)
（5）重組反應產物鑒定：菌液PCR、測序。
圖1 表達質粒示意圖
5. 同源重組法與傳統(tǒng)酶切法的對比？
同源重組法對酶切位點的依賴性較低，構建耗時較短，構建過程簡單可以省去很多精力，但假陽性率略高。
傳統(tǒng)酶切法應用的時間長、技術成熟，但依賴于酶切位點的選擇，酶切效率與連接效率低且構建過程比較繁瑣。
6. 載體構建技術的應用？
（1）構建克隆載體用于擴增目的基因；（2）構建表達載體用于表達目的基因；（3）構建基因編輯載體用于編輯基因；（4）構建病毒包裝載體用于轉染細胞。
標簽：
卡梅德 載體構建
