LRRK2-IN-1

　　LRRK2-IN-1 是一種有效的，選擇性的 LRRK2 抑制劑，作用于 LRRK2 （G2019S） 和 LRRK2 （WT），IC50 值分別為 6 nM 和 13 nM。

 

 

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　　野生型和G2019S的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致TR-FRET信號(hào)高2.5倍，LRRK2-IN-1可以以劑量依賴的方式抑制TR-FRET信號(hào)，IC50值分別為0.08?M和0.03?M。LRRK2-IN-1抑制DCLK2的IC50值為45 nM，在AURKB、CHEK2、MKNK2、MYLK、NUAK1和PLK1的生化檢測(cè)中，IC50值大于1?M。LRRK2-IN-1抑制MAPK7, EC50為160 nM。LRRK2- in -1誘導(dǎo)Ser910和Ser935磷酸化的劑量依賴性抑制，同時(shí)失去與野生型LRRK2和LRRK2[G2019S]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中的14-3-3結(jié)合。LRRK2-IN-1對(duì)HepG2細(xì)胞具有中等細(xì)胞毒性，IC50為49.3?M。LRRK2-IN-1分別在15.6?M和3.9?M的S9存在和不存在時(shí)表現(xiàn)出遺傳毒性。LRRK2-IN-1抑制HCT116和AsPC-1細(xì)胞的增殖、遷移，并以凋亡為標(biāo)志誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

 

 

 

　　LRRK2- in -1 （100mg /kg, i.p）誘導(dǎo)小鼠腎臟中LRRK2的去磷酸化。瘤周注射LRRK2-IN-1 （100 mg/kg）可顯著降低異種移植AsPC-1腫瘤的體積和重量。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。同靶點(diǎn)產(chǎn)品：Bafetinib是Bcr-Abl抑制劑

 

 

 

　　瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)cDNA構(gòu)建物36 h后，用谷胱甘肽sepharose從HEK293細(xì)胞裂解液中純化活性GST-LRRK2（1326-2527）、GST-LRRK2 [G2019S]（1326-2527）、GST-LRRK2 [A2016T+G2019S]（1326-2527）酶。肽激酶試驗(yàn)一式兩份，在40?L的總體積中，含有0.5?g LRRK2激酶（純度約為10%，最終濃度為8 nM），50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20?M Nictide, 0.1?M [γ-32P]ATP （500 cpm/pmol）和指示濃度的抑制劑溶解在DMSO中。在30℃下孵育15分鐘后，將35?L的反應(yīng)混合物滴在P81磷酸纖維素紙上，浸泡在50 mM磷酸中，終止反應(yīng)。樣品廣泛洗滌，[γ-32P]ATP摻入Nictide通過(guò)切倫科夫計(jì)數(shù)定量。GraphPad Prism采用非線性回歸分析計(jì)算IC50值。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。

 

 

　　將細(xì)胞（每孔104個(gè)細(xì)胞）接種到96孔組織培養(yǎng)板中，一式三份。LRRK2-IN-1在0、0.31、0.63、1、2、5、10和20 μM的濃度下以DMSO為載體進(jìn)行培養(yǎng)。處理48h后，每孔加入10 μL TACS MTT試劑，37℃孵育至細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)深色結(jié)晶沉淀。在DMSO中加入266 mM NH4OH 100 μL，低速搖板1分鐘。搖勻后，避光孵育10分鐘，使用微孔板讀卡器讀取每孔的OD550。將結(jié)果取平均值并計(jì)算為DMSO（車輛）控制的百分比+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

 

　　MCE尚未獨(dú)立證實(shí)這些方法的準(zhǔn)確性。僅供參考。