表觀遺傳學與腦卒中：DNA甲基化的作用及衰老對血腦屏障修復的影響

腦卒中（俗稱中風）是導致死亡和長期殘疾的主要原因，尤其是對于老齡人來說。腦卒中的平均生存時間為6-7年，許多患者存在身體殘疾和晚期認知功能障礙。腦卒中后的神經功能預后取決于許多因素，包括年齡、梗死面積和部位、遺傳因素以及腦修復程度。腦卒中后的腦修復包括重建血腦屏障（blood–brain barrier，BBB）結構和功能等。鑒定和表征導致BBB修復不完全的因素和過程是成功修復BBB和改善腦卒中后修復的關鍵。

近年來，表觀遺傳學作為組織修復的高階調控機制，在腦卒中發(fā)病機制和腦卒中后修復中發(fā)揮著重要作用。表觀遺傳學指不依賴于DNA序列主要變化的基因表達改變，它依賴于環(huán)境因素和基因組之間的互作。三種表觀遺傳因素對生物體功能至關重要：DNA甲基化、翻譯后組蛋白修飾（例如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化）和非編碼RNA。DNA甲基化模式變化是包括腦血管疾病在內的多種疾病的標志。DNA甲基化在腦卒中和調節(jié)腦卒中后BBB修復中發(fā)揮著重要作用。然而，DNA甲基化與腦卒中后BBB功能和結構完整性之間的相關性仍不清楚。
 
2023年02月28日，美國密歇根大學醫(yī)學院Anuska V. Andjelkovic團隊在《Fluids Barriers CNS》雜志發(fā)表題為“Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood–brain barrier recovery”的研究文章，該研究通過簡化基因組甲基化測序（RRBS）及對應的轉錄組測序（RNA-seq）分析了幼齡（young）和老齡（old）小鼠腦卒中后BBB修復的甲基化和轉錄組圖譜，強調了可能影響B(tài)BB修復的年齡相關過程和因素。

標題：Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood–brain barrier recovery（在血腦屏障修復中的DNA甲基化作用和衰老影響）
時間：2023-02-28
期刊：Fluids and Barriers of the CNS
影響因子：IF 6.961
技術平臺：RRBS、RNA-seq等

研究摘要：
血腦屏障（BBB）功能的不完全修復是腦卒中預后的主要影響因素。腦卒中后BBB如何修復仍然未知。新的證據表明，表觀遺傳因素在調節(jié)腦卒中后血腦屏障（BBB）修復中起著重要作用。本研究旨在評估血栓栓塞性（thromboembolic，TE）腦卒中后腦微血管的表觀遺傳學和轉錄組表征，以鑒定限制BBB修復的潛在原因。研究結果表明，與年齡匹配的對照組相比，對從幼齡（6月齡，young組）和老齡（18月齡，old組）小鼠腦卒中后7天分離的微血管進行RNA測序（RNA-seq）和簡化基因組亞硫酸氫鹽測序（RRBS）分析。比對至注釋基因，腦卒中后微血管的DNA甲基化分析鑒定出老齡小鼠中的11287個差異甲基化區(qū)域（DMR）和幼齡小鼠中的9818個DMR。這些DMR在編碼細胞結構蛋白（如細胞連接和細胞極性、肌動蛋白細胞骨架、細胞外基質）、轉運蛋白和通路（如鉀跨膜轉運蛋白、有機陰離子和無機陽離子轉運蛋白、鈣離子轉運蛋白）、參與內皮細胞過程的蛋白質（如血管生成/血管生成、細胞信號傳導和轉錄調控）基因中富集。甲基化和轉錄組測序的整合分析鑒定出細胞連接（occludin）、肌動蛋白重塑（ezrin）以及Rho GTPase（RhoA和Cdc42ep4）等信號通路變化。衰老作為異常甲基化的樞紐，通過結構蛋白表達（如claudin-5）的深度變化（高甲基化和抑制）以及參與內皮細胞向間質轉化相關基因（如Sox9、Snai1）的激活、抗血管生成和表觀遺傳調控，影響B(tài)BB修復過程。這些結果表明，DNA甲基化通過調節(jié)與BBB修復相關的過程在腦卒中后BBB修復中起重要作用，并普遍與增強BBB損傷過程有關。
 
項目設計：
幼齡C57BL/6雄性小鼠（6月齡）和老齡C57BL/6雄性小鼠（18-20月齡），將血栓栓塞混懸液（8 mg/100μl）注入小鼠頸內動脈。從腦微血管中分離基因組DNA和RNA，進行RRBS和RNA-seq測序分析。
圖1：實驗流程圖
幼齡和老齡小鼠經血栓栓塞（TE）腦卒中處理。在安樂死和微血管分離之前，分別在第1天和第7天進行T2 MRI和T1 MRI以確定梗塞面積和BBB通透性（流入速率常數Ki）。微血管檢測甲基化和轉錄組變化。圖表表示平均值 ±SD，n=5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。


實驗結果
（1）腦卒中后BBB修復的DNA甲基化譜
圖2：TE腦卒中后血腦屏障修復的DNA甲基化分析

1. 在6月齡的小鼠中，全基因組DNA甲基化檢測顯示在TE腦卒中后整體甲基化降低趨勢。數據表示5mC平均百分比±SEM，n=2
2. 差異甲基化區(qū)域（DMR）火山圖，x軸和y軸分別顯示甲基化差異百分比和-log10（q值）。顯著DMR（甲基化差異>25%和q值<0.01）紅色顯示，無統(tǒng)計顯著性DMR以黑色顯示。
3. 條形圖總結了每個基因組區(qū)域（左）和CpG區(qū)域（右）的顯著DMR百分比。高甲基化DMR百分比為紅色，低甲基化DMR百分比為藍色。

D-E.  結構（D）和信號（E）GO分析的基因過表達數據匯總，x軸顯示基因數。
圖3：幼齡小鼠（6月齡）腦卒中后BBB修復中DMR的基因組位點。
A-B.   基因啟動子區(qū)（A）和非啟動子區(qū)域（B）的DMR火山圖
C-G.   細胞連接、極性和肌動蛋白細胞骨架（C）、血管生成和內皮基因（D）、信號通路和轉錄因子（E）、轉運蛋白和通道（F）、細胞粘附和細胞外基質（G）相關基因的差異甲基化。所有DMR，無論統(tǒng)計顯著性如何，均表示為與內皮細胞生物學相關的基因，含有顯著DMR的基因用星號（*）表示�；�因啟動子DMR為紅色，基因體DMR為藍色。位于轉錄起始點上游1-5 kb或無基因組位置的其他DMR為灰色

（2）甲基化組變化對腦卒中后血腦屏障（BBB）修復轉錄組譜的影響
圖4：6月齡小鼠腦卒中后BBB DNA甲基化組和轉錄組圖譜比較分析

1. 差異表達基因（DEG）火山圖。X軸表示log2倍變化，y軸表示−log10（調整后的p值）。顯著性DEG（log2FC的絕對值 > 0.58和調整后的p值 < 0.05）為紅色，無統(tǒng)計學顯著性差異的DEG為黑色。
2. 上調DEG（上）和下調DEG（下）基因過表達分析。
3. 具有差異甲基化啟動子（左）或非啟動子區(qū)域（右）的DEG數量Venn圖。僅統(tǒng)計顯著DEG和DMR。如果一個基因包含多個DMR，則該基因僅計一次。
4. 基因表達和甲基化發(fā)生顯著變化的基因，基因表達變化與啟動子甲基化（左）或非啟動子甲基化（右）之間的Pearson相關性，log2FC位于x軸，甲基化變化位于y軸。啟動子區(qū)域甲基化（R=−0.045，p=0.67）和非啟動子區(qū)甲基化（R=−0.019，p=0.52）均與基因表達呈負相關。標記基因與內皮細胞生物學相關

 
（3）衰老對腦卒中后修復血腦屏障（BBB）DNA甲基化組和轉錄組譜的影響
圖5：衰老對腦卒中后BBB恢復過程中DNA甲基化譜的影響

1. 全基因組DNA甲基化檢測表明，老齡小鼠（18月齡）TE腦卒中后分離微血管（BBB）的整體甲基化水平沒有變化。數據表示5mC含量的平均百分比±SEM，n=2
2. 老齡TE腦卒中小鼠的DMR火山圖，x軸甲基化百分比差異和y軸−log10（q值）。顯著DMR以紅色突出顯示（甲基化差異>25%和q值<0.01），不顯著DMR顯示為黑色。
3. 每個基因組區(qū)域和CpG區(qū)域顯著DMR百分比條形圖。高甲基化DMR用紅色表示，低甲基化DMR用藍色表示。

D-E. 結構（D）和信號（E）的基因過表達GO富集分析。
 
圖6：老齡小鼠（18月齡）腦卒中后BBB修復中DMR的基因組位點


圖7：老齡小鼠（18月齡）腦卒中后血腦屏障DNA甲基化組圖譜比較分析


（4）幼齡和老齡小鼠腦卒中后BBB恢復的共有和特異性轉錄組和DNA甲基化組圖譜
圖8：幼齡和老齡小鼠腦卒中后BBB中DNA甲基化變化的共有和特異性DEG


結論：
腦卒中后血腦屏障（BBB）修復過程中存在DNA甲基化變化，可以調節(jié)修復BBB特性的過程，同時激活和調節(jié)一些導致BBB損傷的因素。本研究通過RRBS、RNA-seq等組學分析研究了不同齡小鼠腦卒中后恢復中的全基因組DNA甲基化模式，定義了BBB恢復的持續(xù)過程（即血管生成、屏障維持、通過Rho-GTPase和Wnt/β-catenin蛋白信號以及EndMT進行的信號調控）及其可能限制恢復過程的表觀遺傳學（甲基化）變化，導致嚴重的BBB損傷。本研究為腦卒中后血腦屏障和腦血管功能下降的病因提供了新的見解，并為藥物發(fā)現(xiàn)和靶向治療開辟了新的途徑。


參考文獻：
Phillips CM, Stamatovic SM, Keep RF, Andjelkovic AV. Epigenetics and stroke: role of DNA methylation and effect of aging on blood-brain barrier recovery. Fluids Barriers CNS. 2023 Feb 28;20(1):14.