永生化細胞系構(gòu)建

1.什么是細胞永生化
細胞永生化是指細胞在體外培養(yǎng)的過程中，由于自身基因變化或者是外界各種刺激條件，避免的正常傳代細胞衰老死亡的過程，以至于可以長期傳代培養(yǎng)、無限分裂增殖。

2.細胞永生化的意義
（1）能獲得大量的細胞資源，改善細胞傳代少、增殖慢的困境，使細胞可以無限傳代，并且永生化的細胞生長更強勁，節(jié)省了實驗周期；
（2）可以幫助研究者熟悉掌握細胞增殖與衰老死亡的的生理過程；
（3）是體外研究腫瘤細胞各個階段的的良好模型，為癌癥治療、抑制癌癥細胞增殖等提供新的研究方向；
（4）在遺傳上屬于同一種群，能夠建立相同遺傳性狀的細胞庫，有助于實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。
 
 
 
 
3.細胞永生化的方法
 
細胞永生化一般有兩種分子機制：外源病毒蛋白抑制或者自身突變導(dǎo)致原癌基因活化或抑癌基因失活，使細胞繞過正常細胞的周期檢查點，細胞衰老死亡途徑受阻，達到無限增殖的目的;另一種是激活端粒酶使端粒長度延長，可以持續(xù)增殖；具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳頭狀瘤病毒HPV等。
細胞永生化有不同的方法，不同的方法適用于不同的組織細胞。如HPV可介導(dǎo)人的上皮細胞如口腔上皮細胞、表皮細胞、角化上皮等的上皮細胞永生化；猿猴病毒的SV40 大T抗原（TAg）用于黏附細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等、EBV用于淋巴母細胞樣細胞；端粒酶TERT則用于間充質(zhì)干細胞和其他一些細胞。
3.1端粒酶TERT
端粒（Telomere）是一種真核細胞染色體末端DNA-蛋白復(fù)合體的特殊結(jié)構(gòu)。端粒有重要的生物學功能，可保護染色體末端的正常結(jié)構(gòu)，免于退化和消亡，因此在染色體正常復(fù)制、細胞凋亡和細胞轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重大作用。端粒酶可以合成新的端粒，從而延長端粒的長度，通常情況下，端粒酶表達量較低，但在病毒介導(dǎo)hTERT下，端粒酶可以正常表達，從而增長細胞的生命周期。
3.2 SV40的T抗原
SV40是真核細胞病毒，SV40的T抗原（TAg）通過與腫瘤細胞內(nèi)抑制因子Rb和p53結(jié)合并抑制其功能而起作用。
3.3原癌基因
研究表明，原癌基因可以激活端粒酶的活性，因此激活Myc, c-Jun, c-Ias, vsrc、Mdm2、RAS、c-fos、Bmi1、CDK4等原癌基因可以促進細胞永生化的進程。
3.4抑癌基因
使抑癌基因p53, pRb, BRCA1, DPC4等失活，同樣可以激活端粒酶，使細胞得到永生化。
 
4.細胞永生化的應(yīng)用
永生化細胞系被廣泛用作功能和分子研究的生物材料來源，并代表了基因組 DNA、表達 RNA 以及蛋白質(zhì)和系統(tǒng)生物學分析的潛在無限來源。此外，這些細胞系可用作各種研究的培養(yǎng)模型，包括功能和血清學研究、分子和遺傳研究、大規(guī)模藥物庫篩選、疫苗研究和高通量生物學研究。
 
5.卡梅德生物可以提供優(yōu)質(zhì)的細胞永生化服務(wù)
卡梅德生物在永生化細胞系方面有著豐富的經(jīng)驗，已成功將不同物種（如人、大鼠、小鼠以及豬）的不同細胞類型，如內(nèi)皮細胞，上皮細胞，成纖維細胞，神經(jīng)元細胞，以及難度較大的懸浮細胞，B細胞、T細胞，巨噬細胞等成功永生化。卡梅德生物提供的B細胞、T細胞和巨噬細胞永生化服務(wù)，目前B細胞永生化的方法主要有與腫瘤細胞融合制備雜交瘤細胞技術(shù)、EBV感染，如圖2所示： T細胞和巨噬細胞永生化的方法主要有SV40感染、EBV感染如圖3所示：
  6.細胞永生化的全流程介紹
以B細胞永生化為例，詳細介紹EBV方法永生化的過程，主要分為B細胞擴增培養(yǎng)，制備EBV，B細胞的制備及EBV感染三大步驟。
6.1 擴增培養(yǎng)B細胞：將 B細胞密度調(diào)整到 (5-10) X 10⁶/L, 37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5-7天，培養(yǎng)期間不更換和補充培養(yǎng)基，以使細胞上清中富含 EBV。
 
6.2制備EBV：收集B細胞上清，離心，除去細胞碎片，收集上清，按超濾離心管說明要求，將上清超濾，收集濾液，按照超濾的先后順序，將獲得 EBV 病毒濃縮液分成 4 份，編號依次為： 1, 2, 3, 4。
6.3 B細胞的制備及EBV感染：將客戶提供的人B細胞按每 5M/ml 鋪扳，分別加入 5 或 10 μl 體積獲得的 EBV 病毒37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.4 EBV感染4周后，如下圖：  
無論何時，細胞永生化在研究生物生長發(fā)育機制，調(diào)控生命活動，疾病診斷治療等領(lǐng)域都有很大的研究意義�？蛻魞H需要提供已經(jīng)分離的PBMC細胞，至少4管，每管細胞數(shù)量>10⁶，剩下的交給卡梅德生物來完成，我們擁有您所需功能的任何物種和任何組織的永生細胞系，可以在短周期內(nèi)完成永生化細胞系的構(gòu)建， 并通過QC確認細胞可以繁殖12-15代，交付您滿意的產(chǎn)品。