CAR-T細胞治療技術(shù)之CAR分子構(gòu)建與慢病毒包裝的常見問題與解答

CAR-T細胞療法是一種新興的腫瘤免疫治療方法，對比傳統(tǒng)的手術(shù)方法具有著自身不可替代的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Α?strong>在CAR-T技術(shù)的實施中，CAR分子構(gòu)建和慢病毒包裝是非常重要的。盡管近些年來，CAR分子設(shè)計和細胞功能的改進有了明顯提高，慢病毒載體的研究也有了很大進展，但距離在臨床上穩(wěn)定應(yīng)用還有很長的路要走。

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Q1：設(shè)計CAR分子時候?qū)θ绾魏Y選合適的抗體scFv序列？
Answer
選擇用于構(gòu)建CAR-T細胞的抗體有兩個很重要的指標：抗體的特異性和親和力。特異性決定了所構(gòu)建CAR-T細胞用于治療的安全性，親和力決定了CAR-T細胞的功能。CAR-T細胞構(gòu)建對所用抗體的親和力要求并不是越高越好，這一點上不同于抗體藥物，而是要有個適當?shù)姆秶�，所以這一點就需要大量的實驗來篩選出親和力適當?shù)目贵wscFv序列。

Q2：CAR-T、CAR-NK以及CAR-Macrophage中使用的CAR分子結(jié)構(gòu)上是否有差異？
Answer
用于構(gòu)建CAR-T的CAR分子一般情況下也適合于構(gòu)建CAR-NK和CAR-M。但是，目前也有不少針對于NK細胞設(shè)計的CAR分子，其主要在共刺激信號分子的使用上不同于CAR-T細胞的CAR分子，例如其使用DAP10和DAP12作為共刺激信號；對于巨噬細胞的CAR分子，其結(jié)構(gòu)中不需要包含共刺激分子只含有CD3ζ信號分子，由于CD3ζ和巨噬細胞Fc受體信號分子的相似性，因此含CD3ζ信號分子的CAR-巨噬細胞也能有效的進行特異性的吞噬作用。

Q3：不引入標簽的情況下，如何實現(xiàn)CAR-T細胞陽性率的檢測？
Answer
目前市面上有應(yīng)該標記的靶蛋白，可以通過這些靶蛋白標記CAR-T細胞結(jié)合流式法來實現(xiàn)CAR-T細胞陽性率的檢測；另外，如果有針對CAR蛋白scFv的抗抗體，也可以使用抗抗體來檢測。

Q4：CAR慢病毒的滴度需要達到多少才能用于CAR-T細胞構(gòu)建，除滴度這一指標外，慢病毒還進行哪些指標的檢測？
Answer
一般要求活性滴度要大于1×10^8Tu/ml，除滴度這一指標外，一般會進行無菌、支原體以及內(nèi)毒素等常規(guī)檢測。

Q5：我們構(gòu)建的CAR-T細胞陽性率總是過低應(yīng)該如何解決？
Answer
一方面可以提高慢病毒的質(zhì)量，例如滴度純度等；另一方面，可以通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件等；再一方面可以通過優(yōu)化CAR分子的結(jié)構(gòu)，因為CAR分子的結(jié)構(gòu)以及其穩(wěn)定性都是影響CAR-T細胞陽性率的重要因素。