AO/PI雙熒光染色技術(shù)操作使用指南

臺盼藍(lán)染色作為活細(xì)胞計數(shù)的首 選方式，可將細(xì)胞膜不完整的死細(xì)胞染成藍(lán)黑色，通過在鏡下和未被染色的活細(xì)胞進(jìn)行對比并計數(shù)，從而可快速了解細(xì)胞樣品的活率和濃度。但在實(shí)際使用過程中，臺盼藍(lán)染色計數(shù)會出現(xiàn)以下問題：

臺盼藍(lán)染色的特異性不強(qiáng)，常會將原代細(xì)胞的碎片、PBMCs中殘留的紅細(xì)胞計入總數(shù)；

臺盼藍(lán)細(xì)胞毒性較大，且染料配制濃度無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致在進(jìn)行多樣品計數(shù)時由于間隔時間過久而結(jié)果誤差較大。

臺盼藍(lán)染色
 

而AO/PI染色法可解決這些問題。AO（Acridine Orange）又稱為吖啶橙，PI（Propidium Iodide）又稱為碘化丙錠，可分別將DNA染成綠色和紅色，而碎片和雜質(zhì)或哺乳動物紅細(xì)胞由于沒有細(xì)胞核不會被染色，同時細(xì)胞毒性非常小，所以廣泛應(yīng)用于原代細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞治療、生物制品等領(lǐng)域。
 

AO/PI雙熒光染色
 

多數(shù)情況下，市面上可以見到很多預(yù)配制的染液，細(xì)胞樣本在染液終濃度為2-25μg/mL時，孵育5–30分鐘，將可以發(fā)出明亮的核染色熒光。但是實(shí)際應(yīng)用時，由于細(xì)胞類型、染色條件以及檢測儀器的參數(shù)不同，實(shí)際呈現(xiàn)的效果也不一樣。此時，只需按照下文中提供的染色方案即可獲得較為穩(wěn)定的染色結(jié)果。

AO/PI快速染色方法：
①預(yù)先配置（50μg/mL PI， 10μg/mL AO）的染色預(yù)混液；

②吸取 10μL 細(xì)胞樣本至 EP 管中，加入等體積的 AO/PI 預(yù)混染色液，吹打混勻后孵育 5min（終濃度 25μg/mL PI， 5μg/mL AO）；

③輕微吹打后，吸取 10μL 染色后的細(xì)胞上樣至細(xì)胞計數(shù)板中進(jìn)行分析，推薦使用瑞沃德自動細(xì)胞計數(shù)儀C100/C100-Pro，可精準(zhǔn)區(qū)分AO/PI雙熒光染色后的活死細(xì)胞，一鍵計數(shù)，精準(zhǔn)快速。

瑞沃德自動細(xì)胞計數(shù)儀C100/C100-Pro，除了可用于AO/PI熒光細(xì)胞計數(shù)，還可廣泛適用于細(xì)胞計數(shù)分析、細(xì)胞活力分析、細(xì)胞大小分析、檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率（GFP、RFP）等多重應(yīng)用場景分析，助你輕松分析細(xì)胞數(shù)量、活力、大小和熒光強(qiáng)度！
 

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