文獻解讀：代謝流與脂質組手段探究肝癌細胞抗放療真相

代謝組學資訊：利用代謝流與脂質組手段探究肝癌細胞抗放療真相
文章標題：Integration of Glucose and CardiolipinAnabolism Confers Radiation Resistance of Hepatocellular Carcinoma

發(fā)表期刊：HEPATOLOGY
發(fā)表時間：2021.9.24
影響因子：17.4
合作客戶：南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院
百趣生物提供服務：代謝組學代謝流檢測分析及脂質組分析 

研究背景

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有預后不佳的特點，而放射治療(RT)是少數(shù)幾種臨床可行的治療方法之一，但由于固有的或獲得性耐藥，其療效一直受到限制。最近，越來越多的證據表明，代謝重編程在幾種癌癥類型中起到輻射抵抗的促進作用。腫瘤代謝重新編程的中心組成部分之一是有氧糖酵解(也稱為Warburg效應)，其中間代謝產物葡萄糖可以被輸送到合成代謝途徑，如從頭合成脂肪、氨基酸合成和核苷酸合成，從而促進腫瘤細胞的增殖和進展，抑制細胞凋亡。因此，葡萄糖經常作為腫瘤其他代謝途徑的代謝基礎，然而，代謝變化產生的代謝物如何以及哪些代謝產物與電離輻射(IR)誘導的細胞凋亡有關仍不清楚。在這里，作者通過比較不同肝癌細胞的代謝依賴性與固有或獲得性放射抵抗描繪了抑制細胞凋亡驅動放射抵抗的綜合代謝機制，并提出了破壞輻射增敏的代謝依賴性的治療策略。

研究結果

01固有放射抵抗細胞系篩選與獲得性放射抵抗細胞系培養(yǎng)1
克隆形成分析顯示，隨著IR劑量的增加，肝癌細胞系的放射敏感性發(fā)生了變化(圖1A)。值得注意的是，QGY-7701是使用的抗性最強的品系。由于MHCC97H和MHCC97L細胞系對IR相對敏感且克隆能力較弱，作者將它們分別暴露在常規(guī)或次分級IR中，目的是在不同的分割方案下產生獲得性IR抗性(IR-R)亞系(圖1B)。并通過細胞計數(shù)試劑盒8(CCK8)試驗、MTT細胞毒性試驗、克隆形成存活試驗和中性彗星試驗(圖1C-E)確定了IR-R亞系的抗輻射狀態(tài)。
 

圖1. 肝癌細胞系對IR的響應及耐輻射亞系的產生

02、葡萄糖代謝增強了肝癌細胞的放射抗性
為了探索抗輻射的分子機制，作者觀察到與MHCC97H對照組相比，MHCC97HIR-R抗輻射組中的多種代謝途徑在蛋白水平上顯著變化(圖2A)。隨后作者分別在葡萄糖、谷氨酰胺或血清剝奪條件下培養(yǎng)細胞，以檢測抗輻射細胞的能量來源；并以營養(yǎng)豐富的條件作為對照。與最近表明葡萄糖代謝具有輻射防護作用的報告一致，只有剝奪葡萄糖會促進IR-R細胞的死亡(圖2B)。由于大多數(shù)高度依賴葡萄糖的癌細胞在受到葡萄糖阻斷時往往會被迫發(fā)生凋亡，因此可以發(fā)現(xiàn)抗輻射細胞在低糖條件下表現(xiàn)出顯著的凋亡和存活率降低(圖2C)。IR-R細胞表現(xiàn)出比它們的親代對照細胞更高的葡萄糖攝取量，并且在低氧條件下差異更大(圖2D)。同時參與葡萄糖代謝的酶，如HK2、GLUT1、SLC2A1和PFKL，在IR-R細胞中的表達也增加；IR和低糖培養(yǎng)條件的結合協(xié)同導致IR-R細胞中克隆形成的存活率大大降低，但在親代細胞中則沒有發(fā)生這種現(xiàn)象(圖2E，F(xiàn))�？偠�言之，這些發(fā)現(xiàn)證實了抗輻射的肝細胞癌細胞對葡萄糖的依賴性增加。
 

圖2. 葡萄糖代謝增強了肝癌細胞對放射的抵抗能力

03、葡萄糖對心磷脂合成的增強促進了放射抵抗肝癌細胞細胞色素c的釋放
為了進一步明確葡萄糖在親本細胞和抗輻射細胞中的流向變化，進而探究葡萄糖是通過怎樣的代謝重編譯來增強肝癌細胞對放射的抵抗能力，作者進行了U-13C葡萄糖示蹤的代謝流質譜分析。通過代謝流實驗作者發(fā)現(xiàn)，在MHCC97H細胞中，葡萄糖流向主流糖酵解代謝產物和三羧酸(TCA)循環(huán)衍生代謝物的速度比IR-R細胞快，而在IR-R細胞中，葡萄糖流向分支代謝物(如絲氨酸和甘氨酸)的流量增加。結合相關蛋白表達量數(shù)據和IR-R細胞中較高的HK2活性但較低的乳酸含量，作者推測IR-R細胞可能通過靈活組裝分配糖酵解的中間代謝物以增強分支合成代謝來對抗輻射(圖3A)。通過非靶代謝組的實驗作者進一步發(fā)現(xiàn)甘油磷脂（GPL）的代謝通路發(fā)生了顯著的變化(圖3B)。而因為GPL的合成需要依賴于游離脂肪酸和甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸又來源于脫氫二羥丙酮磷酸(DHAP)，所以GPL的合成正好將葡萄糖代謝與脂代謝所串聯(lián)在一起。而在各種GPL中，心磷脂(CLS)是一種結構獨特的磷脂，僅在線粒體中合成。早期研究表明，CL水平的增加可以加強細胞色素c的膜結合，從而使細胞在受到凋亡刺激時更有可能存活。由于細胞色素c介導的凋亡是IR引起的主要死亡方式之一，為了探究CL合成是否與輻射抵抗有關。作者首先進行了脂質組學研究，以確定MHCC97H親本細胞和IR-R細胞中脂質譜的整體變化。結果表明，IR-R細胞內顯著積聚的脂質主要由GPLs組成。更重要的是，與親本細胞相比，IR-R細胞中磷脂酰甘油(PG；CL合成酶1[CRLS1]消耗的脂類)的種類減少，而CL合成的種類增加，這意味著CL合成的增強(圖3C)。
 

圖3. 代謝組揭示了抗輻射肝癌細胞中葡萄糖向CL合成代謝流量的增加

為了研究細胞色素c的潛在作用。作者隨后使用了抑制細胞色素c釋放的小分子鹽酸二甲胺四環(huán)素(M-HCl)來處理細胞。通過前期實驗發(fā)現(xiàn)到IR后親代細胞中細胞色素c的在胞漿中增加了，M-HCl處理顯著恢復了IR誘導的細胞凋亡，而在IR-R和QGY-7701細胞中沒有觀察到這種變化或恢復作用，表明細胞色素c的釋放在一定程度上被阻止在輻射抵抗的肝癌細胞中(圖4A)。為了進一步確定該塊是否依賴CLs，我們針對CRLS1產生了小干擾(si-)RNA來預處理抗輻射細胞。結果表明，在被試細胞中抑制CRLS1可以相應地促進細胞色素c的釋放，降低細胞CL含量，并在IR處理時顯著增加細胞死亡(圖4B)�？偠�言之，這些數(shù)據表明，葡萄糖和CL合成代謝的整合通過調節(jié)肝癌細胞中細胞色素c的分泌來調節(jié)輻射抗性。
 

圖4.HIF-1α和SREBP1介導的葡萄糖到CL合成代謝的增加抑制了抗輻射

04、mTORC_1通過促進HIF-1α和SREBP_1的翻譯介導肝癌細胞的輻射抗性
1根據前文的數(shù)據顯示，低氧進一步擴大了IR-R和親本細胞對葡萄糖的吸收差異（圖2D），同時IR-R細胞中缺氧誘導因子-1(HIF-1)的信號增加。為了探究抗輻射細胞的葡萄糖依賴是否受HIF-1α調控。當轉錄調控葡萄糖合成代謝時，HIF-1α會使mTORC1信號的激活，mTORC1信號是刺激類固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)調節(jié)脂肪生成所必需的。

作者接下來構建了HIF-1α和SREBP1下調的抗輻射肝癌細胞系。結果表明，具有HIF-1α或SREBP1基因敲除的耐藥細胞分別抑制了參與葡萄糖代謝或CL合成的下游代謝靶點(圖4C)。在功能上，抑制HIF-1α或SREBP1可顯著降低放射抗性，減少細胞CL含量，并加速IR誘導的耐藥肝癌細胞細胞色素c的釋放(圖4D)。隨后作者通過對HIF-1α或SREBP1多聚體的檢測發(fā)現(xiàn)，mTORC_1并非是在轉錄水平，而是在轉錄后翻譯階段介導了肝癌細胞的輻射抗性。

研究小結

綜上所述，該研究破譯了葡萄糖和CL合成代謝的整合，由mTORC1HIF-1α/SREBP1信號調節(jié)，通過抑制獲得性和內在放射抵抗的肝癌細胞中細胞色素c的釋放來介導輻射抵抗(圖5)。隨著RT在肝癌治療中的逐步興起，了解這種代謝性腫瘤的代謝脆弱性并闡明其潛在的機制可能有助于確定對肝癌患者進行更有效的綜合治療。

圖5. 工作模型描述了驅動葡萄糖和CL合成代謝的機制。

FFA，游離脂肪酸；F6P，果糖-6-磷酸；F1，6P，果糖-1，6-二磷酸；G6P，葡萄糖-6-磷酸；IHC，免疫組織化學；ROS，活性氧

科研延伸
BIOTREE靶向代謝流分析通過領先的技術手段對三羧酸循環(huán)（TCA） 糖酵解途徑（EMP） 戊糖磷酸途徑（PPP）三大主要能量代謝途徑上共計50+關鍵代謝物進行高通量靶向代謝組學檢測，高效準確的確定樣本中代謝物的變化，隨后采用針對代謝流開發(fā)的算法分析代謝物的流向與流量變化，極大地豐富了數(shù)據挖掘的深度。

更多高分文章在公眾號阿趣代謝組學
文/阿趣代謝組學