細胞治療中動物模型的選擇

自2017年第一款CAR-T藥物Kymriah被FDA批準以后，目前全球共有8款CAR-T 藥物上市，并且全球的研發(fā)管線中，除了CAR-T以外，其他T細胞療法（TCR-T、TIL、NKT、TAA-targeted T）及其他細胞療法（NK、 DC、干細胞、髓系細胞）均有大幅增長。很多科學家預言，細胞治療將成為未來腫瘤治療的重要手段。

 

細胞治療作為一種新興的治療手段，還有很多問題和挑戰(zhàn)有待科學家及研發(fā)學者們解決，例如靶向實體瘤的有效性、復雜性細胞療法的制備和臨床實施障礙等。本文就CAR-T細胞的臨床前體內試驗這一環(huán)節(jié)，將講述如何選擇更優(yōu)的動物模型，提高臨床轉化率。因為合適的臨床前藥效研究模型，可以加速免疫藥物研發(fā)和開發(fā)新型組合療法的進程，最大程度減少臨床試驗失敗風險。

 

1.提及細胞治療時， 我們首先選用什么動物模型呢？

選擇合適的動物模型可用于CAR-T細胞功能的概念驗證。但由于物種差異，在動物模型內會存在CAR-T細胞和腫瘤靶點的物種特異性、異種移植物抗宿主反應、在動物中模擬人類免疫反應困難等問題，沒有一種完美的模型可以完全模擬臨床上的反應。

 

但在人源化小鼠模型（在這里指人類腫瘤異種移植小鼠模型）中進行的體內試驗可以提供有關CAR-T細胞藥效、分布和增殖特征的信息。并且在這些人源化小鼠模型上進行的臨床前測試和評估已經成為驗證這些細胞療法的黃金標準，并獲得監(jiān)管部門的批準。

2022年3月15日，F(xiàn)DA頒布《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》草案

 

這里的人源化模型，最廣泛使用的是超重度免疫缺陷NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse/ (NOG/NSG)小鼠，原因是什么呢？

• NOG小鼠缺乏小鼠T、B、NK和功能性樹突狀細胞，更容易接受人類腫瘤細胞系、腫瘤組織和健康組織的移植。
• CAR-T等人源T細胞，在NOG小鼠上被動物排斥較小，可進行CAR-T等細胞藥物的有效評估。其他模型由于免疫系統(tǒng)的存在，會對人源細胞治療藥物進行排斥。這是細胞治療需要選用超重度免疫缺陷鼠NOG非常重要的原因。
• NOG小鼠可支持人類造血干細胞的移植及免疫細胞的發(fā)育。
• NOG/NSG的異種移植模型已經為研究人類免疫系統(tǒng)和血液瘤之間相互作用的平臺，尤其是血液瘤的PDX移植，可以同時將人的免疫細胞植入，比較好地模擬了腫瘤細胞以及腫瘤微環(huán)境(例如，免疫細胞)在體內的呈現(xiàn)。

 

Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies

    

Preclinical modeling of CAR T Cell therapy in humanized cancer mice models.(A) Different humanized mice models for preclinical modeling of different malignancies.(B) The relevant preclinical data for CAR T cell treatment obtained for the indications in (A).

 

慢性淋巴細胞白血病(CLL)是成人最常見的白血病，一些患者接受CAR-T治療后能夠得到緩解，但很多患者由于T細胞衰老，療效有限。

 

2022年Funk CR等的最新研究表明，CAR-T細胞培養(yǎng)過程中添加雙pi3k δ/γ抑制劑duvelisib可以增加干細胞記憶性CD8+ CART細胞的產量，改變表觀遺傳修飾：CD4/CD8比值標準化、線粒體質量增加。賦予CD28和41BB CAR-T在NOG小鼠體內更大的體內擴張和抗腫瘤活性

https://ashpublications.org/blood/article/139/4/523/476855/PI3K-inhibition-promotes-human-CART-cell

 

2.特殊情況下的更優(yōu)模型選擇

雖然NOG小鼠為細胞治療的臨床前功能藥效提供了重要的數(shù)據(jù)支撐，但隨著細胞治療研究的深入及擴展，一些情況下需要新一代的NOG模型，才能更好地支持研究結果的準確性。

• 降低GvHD風險，長期的T細胞治療藥效評估
• 臨床前T細胞治療實體瘤，如何更貼近臨床？
• NK細胞治療如何擺脫臨床前在小鼠體內無法發(fā)揮藥效的困境？

 

這些情況下應該選擇哪種更優(yōu)的模型？我們一起來分析一下吧

 

雖然NOG小鼠在細胞治療的臨床前功能藥效驗證了發(fā)揮了非常重要的作用，但越來越多的研發(fā)學者發(fā)現(xiàn)將人成熟T細胞轉移到NOG小鼠，會導致移植物抗宿主病(GvHD)，這非常不利于CAR - T細胞治療的長期藥效評估。

Xeno-GvHD異種移植發(fā)生有以下三個先決條件

• 移植的T細胞有免疫活性
• 宿主對移植物來說是異己
• 宿主無力對移植物發(fā)動有效免疫攻勢

 

人源PBMC或者CAR-T等來源的T細胞移植到NOG小鼠中，符合以上三個先決條件，導致GvHD會不可避免的發(fā)生。當然GvHD的嚴重程度也跟CAR-T細胞來源的donor，CAR設計的特異性，注射劑量等有關。

 

如何降低臨床前動物實驗由于物種差異，而導致的這種異源T細胞移植引起的Xeno-GvHD呢？如何更好地進行T細胞藥物評估呢？

NOG-MHC I/II-2 KO（NOG-dKO）小鼠是首選推薦的臨床前動物模型。NOG-dKO小鼠敲除了小鼠的MHC I/II 分子，使得移植的T細胞無法對小鼠識別，從而無法進行免疫攻擊，大大減緩了GvHD, 為研發(fā)者提供了充足的研發(fā)周期。

 

由于CAR-T自體治療的局限性，科學家們越來越傾向于選擇異體來源T細胞，其中誘導性多能干細胞iPSCs是一重要來源。

 

2021年日本京都大學誘導多功能干細胞研究中心（Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University）的研究結果表明：經基因改造的低免疫原性iPSC衍生的T細胞可能有助于現(xiàn)成的T細胞免疫療法的產生。同時表明NOG-dKO(MHC-I- and MHC-II-knockout NOG)小鼠減少異種GvHD反應，這將增加iPS-T細胞的觀察時間，并且能為iPS-T細胞治療提供更準確的臨床預測。

ang, B., Iriguchi, S., Waseda, M. et al. Generation of hypoimmunogenic T cells from genetically engineered allogeneic human induced pluripotent stem cells. Nat Biomed Eng 5, 429–440 (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-021-00730-z

 

NOG-dKO小鼠的額外優(yōu)勢

利用NOG-dKO小鼠除了解決了部分CAR-T細胞療法中窗口期短的問題，對CAR-T細胞因子風暴評估的準確及合理性也有重要的作用。

 

CAR-T細胞療法顯著的副作用之一就是可能會產生細胞因子風暴，需要在臨床前進行合理的評估。臨床上腫瘤患者接受CAR-T細胞療法后，會出現(xiàn)CAR-T細胞的增殖，同時會產生細胞因子釋放增多的現(xiàn)象，但隨著腫瘤的消退，CAR-T細胞量及細胞因子釋放量都會減少。但臨床前在基礎的NOG小鼠上，由于CAR-T細胞移植后Xeno-GvHD的產生，會導致非特異性T細胞的擴增，隨著腫瘤的消退，細胞因子釋放量也不會減少，與臨床上的差異較大。

 

NOG-dKO小鼠由于消除了Xeno-GvHD, 除了更準確地評估T細胞治療藥物的藥效外，對細胞因子的釋放也可做初步的評估。目前已有一些CAR-T研發(fā)者傾向于使用NOG-dKO小鼠，除了可以滿足長期的藥效評估，同時還可進行細胞因子釋放的評估。

 

CAR-T/TCR-T/TIL等治療實體瘤的臨床前“重要發(fā)現(xiàn)”：

2017 年，Dr. Jonas Nilsson 的研究發(fā)現(xiàn)，ACT 的抗腫瘤活性與細胞因子 IL-2 有關，hIL-2 NOG 自體腫瘤模型有助于重現(xiàn)患者對治療的反應，而NOG小鼠無法重現(xiàn)。

 

2019 年，Elin Forsberg 的進一步研究發(fā)現(xiàn)，在 hIL-2 NOG 小鼠可觀察到 HER2 CAR-T 治療實體黑色素瘤的體內療效 , 且這種功效僅在 hIL-2 NOG 模型中可見，而在基礎的 NOG小鼠中并未出現(xiàn)。目前越來越多的研究表明，hIL-2 NOG 小鼠是評估臨床前T細胞治療實體瘤的重要模型。

 

NOG小鼠在血液瘤中可以很好地評估T細胞治療效果。但在一些實體瘤中，由于小鼠中缺少人源的細胞因子IL-2等，復雜的腫瘤免疫微環(huán)境導致T細胞無法浸入，使得T細胞療法無法在臨床前得到有效評估。hIL-2 NOG小鼠中人源IL-2細胞因子的持續(xù)表達，將有利于更好地貼近臨床患者的情況，得到更準確的臨床預測。

 

2022AACR會議上，Lovance Biotherapeutics報道了一款基因修飾的TL細胞治療(PDCD-1KO)的臨床前體內治療效果：

 

利用hIL-2 NOG小鼠，發(fā)現(xiàn)PDCD-1 KO TIL的治療效果遠高于MOCK TIL和PD-1聯(lián)合給藥組。表明了內源性的敲除PDCD-1將在TIL治療中發(fā)揮非常重要的作用。這些結果表明PDCD-1 KO TIL（IOV-4001）是一種治療實體瘤的非常有潛力的臨床選擇，該項成果即將在黑色素瘤及非小細胞肺癌中開展臨床研究。

Preclinical Activity And Manufacturing Feasibility of Genetically Modified PDCD-1 Knockout(KO) Tumor-infiltrating Lymphocyte(TIL) Cell Thetapy.

 

提到NK細胞治療，我們要清楚NK細胞與T細胞的增殖差異。NK細胞擴增需要通過白介素等外界因子的刺激作用，才能促使NK細胞自我復制和增殖。

 

日本CIEA的研究數(shù)據(jù)表明，將人源的NK細胞直接移植到NOG小鼠中，移植后1-2周，在外周血中已檢測不到人源NK細胞。而在hIL-15 NOG小鼠中，人源NK細胞移植后，NK細胞可維持12周以上，絕對數(shù)量在移植后4-5周左右達到峰值。

 

故臨床前NK細胞治療的藥效評估，如果缺少人源細胞因子，NK細胞則無法發(fā)揮藥效。hIL-15 NOG小鼠可持續(xù)表達人源細胞因子IL-15, 有利于動物體內人源NK的增殖及維持，從而進一步發(fā)揮抗腫瘤藥效。

 

3.總結

NOG小鼠的超重度免疫缺陷特性，為細胞治療的臨床前藥理藥效及毒理評估提供了非常重要的數(shù)據(jù)支撐。但針對不同的細胞治療、不同的癌種適應癥及研發(fā)者不同的關注點等，我們需要根據(jù)實際情況選用不同的新一代NOG小鼠，以更好地模擬臨床患者情況，提高準確性。

 

本文重點關注了細胞治療中藥理藥效的動物模型選擇，在動物模型中的臨床前安全性評估同樣不可忽視。NOG小鼠由于超重度免疫特性，可以為這些細胞治療的致瘤性風險提供非常好的安全性評價。

NOG小鼠作為超重度免疫缺陷鼠，對細胞致瘤性非常敏感，且自發(fā)性腫瘤率極低，壽命長，是致瘤性安全測試的較好模型。日本NIHS（National Institute of Health Sciences ）的研究結果表明，NOG小鼠是hiPSCs細胞藥物致瘤性測試的優(yōu)選模型。

 

NOG及新一代NOG小鼠盡管可以提供一些簡單的藥物毒性分析，但由于缺乏人源免疫系統(tǒng)，CAR-T無法模擬CRS在這些免疫缺陷小鼠中引起的級聯(lián)反應，這些現(xiàn)象在臨床患者中卻可能會發(fā)生；另外，在這些模型中也無法評估CAR-T細胞和其他免疫細胞/組織之間的相互作用。目前沒有一個完美的模型可以用來評估這些新興細胞治療的安全性，但有研究表明，免疫系統(tǒng)重建的人源化小鼠是目前預測神經毒性、細胞因子風暴評估、CAR-T對局部組織的影響和巨噬細胞激活綜合征(MAS)的最佳臨床前研究系統(tǒng)。